植物果实中维生素C合成代谢及其基因表达研究.pdf

第 43 卷第 3 期2024 年 3 月中 国 野 生 植 物 资 源Chinese Wild Plant ResourcesVol.43 No.3Mar.2024植物果实中维生素C合成代谢及其基因表达研究尹崇鑫1，李祖夏1，王路昊1，乔枫1，2，3*（1.青海师范大学 生命科学学院，青海 西宁810008；2.青海师范大学 高原科学与可持续发展研究院，青海 西宁810008；3.青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海 西宁810008）摘要 维生素C（Vitamin C），又名抗坏血酸（Ascorbate acid，AsA），是生物体中具有多效功能的必需化合物。整理了植物果实中维生素C的生理功能以及其中参与维生素C合成的L-半乳糖途径、D-半乳糖醛酸途径、L-古洛糖途径、肌醇途径和维生素C循环途径，并分析了相关基因的功能和表达。对参与维生素C合成与循环的16个基因：PMI、PMM、GMP、GME、GGP、GPP、GalDH、GLDH、GalUR、MIOX、GuLDH、MDHAR、DHAR、AO、APX、GR，及其在维生素C代谢途径中的作用进行了综述。植物果实中维生素C合成代谢途径多样，关键基因的表达会在不同程度上影响其合成代谢，了解植物果实中维生素C合成代谢及相关基因的功能和表达，可为生产富含维生素C的转基因水果和蔬菜奠定基础。关键词 维生素C；维生素C生物合成；调节；基因调控；代谢途径中图分类号：Q949 文献标识码：A 文章编号：1006-9690（2024）03-0095-06Research on Vitamin C Synthesis Metabolism and Gene Expression in Plant FruitsYin Chongxin1，Li Zuxia1，Wang Luhao1，Qiao Feng1，2，3*（1.School of Life Science，Qinghai Normal University，Xining 810008，China；2.Institute of Plateau Science and Sustainable Development，Qinghai Normal University，Xining 810008，China；3.Key Lab.of Medicinal Animal and Plant Resources on the Qinghai Tibet Plateau，Xining 810008，China）Abstract Vitamin C，also known as Ascorbate acid（AsA），was an essential compound with multiple functions in many organisms.This article reviewed the physiological functions of vitamin C in plants，as well as the L-galactose pathway，D-galactouronic acid pathway，L-gulose pathway，inositol pathway and ascorbic acid cycle pathway involved in AsA synthesis in plant fruits，and analyzed the functions and expressions of related genes.16 genes involved in the synthesis and circulation of AsA：PMI，PMM，GMP，GME，GGP，GPP，GalDH，GLDH，GalUR，MIOX，GuLDH，MDHAR，DHAR，AO，APX，GR，and their roles in AsA metabolic pathways were reviewed.The pathways of AsA synthesis and metabolism in plant fruits were diverse.And the expressions of key genes affected the synthesis and metabolism of AsA in fruits to varying degrees.Understanding the function and expression of AsA synthesis and related genes in plant fruits could lay the foundation for the production of transgenic fruit and vegetable rich in AsA.Key words Vitamin C；Ascorbate biosynthesis；Regulation；Genetic control；Metabolic pathways维生素 C（Vitamin C）或 L-抗坏血酸（Ascorbic acid，AsA），是六碳糖衍生物 L-threo-hex-2-enodoi：10.3969/j.issn.1006-9690.2024.03.014收稿日期：2023-05-19，录用日期：2024-03-08基金项目：中藏药材绿色高值化与标准化生产技术集成与示范推广项目（2023-NK-P38）；青海师范大学大学生创新创业训练项目（qhnucxcy2023058）。作者简介：尹崇鑫（2000-），男，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail：*通讯作者：乔枫（1973-），女，教授，博士，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail： 95中 国 野 生 植 物 资 源第 43 卷no-1，4-lactone 的 通 用 名 称，为 L-抗 坏 血 酸（AsA）、L-单 脱 氢 抗 坏 血 酸（Monodehydroascorbate，MDHA）和 L-脱氢抗坏血酸（Dehydroascorbate，DHA）及其氧化产物的总称1。维生素 C 于1928年首先被发现，是Albert Szent-Gyrgyi从肾上腺皮质中分离出的一种可以作为强还原剂的内酯化合物。1932年，Charles Glen King从柠檬汁中分离出一种抗坏血酸化合物，并证明了其化学结构为己糖醛酸2。维生素C是动植物新陈代谢中必不可少的抗氧化分子，也是许多酶的辅助因子3。人类获取维生素C的最佳途径是饮食，食用植物是其中的主要方式。尽管合成维生素C在化学结构上与植物来源的维生素C难以区分，但水果和蔬菜具有的多种微量营养素和植物化学物质能够影响维生素C的生物利用度。植物果实中的维生素C含量较高，本文主要就植物果实中维生素C的研究进行综述，分析植物果实维生素C合成代谢及相关基因的功能和表达，为生产富含维生素C的转基因水果和蔬菜奠定基础。1植物果实中维生素C的生理功能维生素C是人类饮食中必不可少的维生素，通过酶促和非酶促反应直接或间接中和活性氧（Reactive oxygen species，ROS），在保护人体必需的生物分子（蛋白质、脂质、碳水化合物、DNA和RNA等）免受自由基（如羟基自由基、超氧化物、单线态氧和过氧化氢）损害方面发挥着重要作用4。维生素C在果实叶绿体中具有不同的功能，对于光合作用的正常进行至关重要。首先，维生素C在直接清除ROS和H2O2方面具有关键作用；维生素C还参与叶黄素循环，保护光系统II（PSII）免受光抑制；最后，维生素C可以向2个光系统提供电子。维生素C含量的变化显著改变了与光合作用相关的基因的表达。通过抑制 DHAR 表达降低维生素 C 含量，会导致植物叶绿素a、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（RuBisCO）大亚基以及CO2同化量的减少。维生素C能够通过维持光合作用功能以及限制ROS介导的损伤来减缓叶片衰老5。还能够作为1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACA）氧化酶的辅助因子，参与植物激素乙烯的合成。也可作为双加氧酶的辅助因子，参与脱落酸和赤霉素的合成，以及生长素的分解代谢6。维生素 C 和激素信号传导之间的复杂相互作用能够干预植物果实不同阶段的生长发育以及对环境和病原体的反应7-8。根据病原体生活方式不同，维生素C参与不同的防御反应8。果实对活体营养型病原体的防御是由水杨酸信号介导的，而对死体营养型病原体的防御是由茉莉酸和乙烯信号介导的2。在植物果实中，维生素C可以控制细胞的 分 裂、伸 长 和 分 化，以 及 程 序 性 细 胞 死 亡（PCD）2。2植物果实中维生素C主要生物合成代谢途径研究维生素 C 在植物果实中的生物合成途径涉及 D-甘露糖/L-半乳糖（D-Man/L-Gal）合成途径、D-半乳糖醛酸（D-GalA）合成途径、L-古洛糖（L-Gulose）合 成 途 径 和 肌 醇（Myo-inositol）合 成 途径2（图1）。2.1L-半乳糖途径植物主要能够通过L-半乳糖途径进行维生素C 的合成12-13。来源于 D-葡萄糖的 6-磷酸-D-果糖，通过 6-磷酸甘露糖异构酶（Phosphomannose isomerase，PMI）转化为6-磷酸-D-甘露糖（M6P），接 着 通 过 磷 酸 甘 露 糖 酶（Phosphomannomutase，PMM）形成1-磷酸-D-甘露糖（M1P），再通过GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GDP-D-mannose pyrophosphorylase，GMP）形成GDP-D-甘露糖，后在甘露糖-3，5-差向异构酶（GDP-D-mannose-3，5-epimerase，GME）11的作用下形成GDP-L-半乳糖，GDP-L-半乳糖在GDP-L-半乳糖磷酸化酶（GDP-L-galactose-phosphorylase，GGP）、L-半乳糖-1-磷酸磷酸 酶（L-galactose-1-phosphate phosphatase，GPP）和 L-半乳糖脱氢酶（L-galactose dehydrogenase，GalDH）催化下，依次转化为1-磷酸-L-半乳糖、L-半乳糖和L-半乳糖-1，4-内酯，后经过L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶（L-galactono-1，4-lactone dehydrogenase，GLDH）转化为维生素C 12。2.2D-半乳糖醛酸途径D-半乳糖醛酸途径是以细胞壁降解产生的甲基-D-半乳糖醛酸酯为前体合成维生素C。其在甲基酯酶的作用下产生D-半乳糖醛酸酯（D-galacturonate），经过 D-半乳糖醛酸还原酶（D-galacturonate reductase，GalUR）的催化，生成L-半乳糖醛酸（L-galactonate），后 在 醛 糖 内 酯 酶（Aldono-lactonase）催化下生成 L-半乳糖-1，4-内脂，进入 L-半乳糖合成途径参与维生素C的合成和循环13。该途径的关键酶是GalUR。该途径对维生素C积累的贡献取决于物种和阶 96第 3 期尹崇鑫，等：植物果实中维生素C合成代谢及其基因表达研究段。D-半乳糖醛酸途径可以补充某些物种的维生素C池大小，例如D-半乳糖醛酸途径被认为是刺梨等的重要次生生物合成途径14，或在特定的发育阶段如成熟的番茄果实15中发挥作用。2.3L-古洛糖途径在L-古洛糖途径中，GDP-L-古洛糖在磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）催化下形成 L-古洛糖-1-磷酸（L-gulose-1-P），后经过糖磷酸酶（Sugar phosphatase）、L-古洛糖脱氢酶（L-gulose-dehydrogenase）依次催化形成 L-古洛糖（L-gulose）、L-古洛糖-1，4-内脂（L-gulose-1，4-lactose），最后在L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶（L-gulono-1，4-lactone oxidase，GulLO）作用下合成维生素C。GDP-L-古洛糖能够通过 GDP-D-甘露糖-3，5-吡喃酶（GDP-D-mannose-3，5-epimerase，GME）催 化 形成 L-半乳糖途径中的 GDP-D-甘露糖。GMP 对GDP-D-甘露糖的催化作用要强于对GDP-L-甘露糖的催化作用16。2.4肌醇途径肌醇（MI）是一种独特的分子，在真核细胞的生长和发育中起着重要作用17。肌醇途径中的L-古洛 糖 酸 会 通 过 古 洛 内 酯 酶（Gulono-lactonase，GNL）的催化，形成L-古洛糖酸-1，4-内酯，进入L-古洛糖途径，最终合成维生素C16。大部分植物合成维生素C的肌醇途径与动物重合，肌醇在植物体内必须经过4个中间步骤才能转化为维生素C 18，这些步骤所包含的酶是：肌醇氧化酶（Myo-inosibol oxygenase，MIOX），D-葡萄糖醛 酸 还 原 酶（D-glucuronate reductase，GlcUR），GNL和 L-古洛内酯氧化酶（L-gulono-1，4-lactone oxidase，GulLO）。其中第1步反应肌醇在MIOX催化下形成D-葡萄糖醛酸被认为是该途径中的重要反应，之后依次在GlcUR、GNL的催化下生成L-古洛糖酸（L-glulonate）、L-古洛糖-1，4-内脂，进入L-古洛糖途径，最终在GulLO催化下合成维生素C16。2.5ASA-GSH循环途径维生素C在经过L-半乳糖途径和L-古洛糖途径合成后，可以通过抗坏血酸氧化酶（Ascorbate oxidase，AO）催化形成MDHA，并消除细胞中的ROS，还可以在抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）的 催 化 下，分 解 H2O2并 合 成MDHA19-20。MDHA 可以通过单脱氢抗坏血酸还原酶（Monodehydroascorbate reductase，MDHAR）催化还原形成AsA，MDHAR是叶绿体中维生素C循环的关键酶21。在该循环中，MDHA能够自发脱氢形成DHA，之后在脱氢抗坏血酸还原酶（Dehydroasorbate reductase，DHAR）作用下被还原为维生素 C。在该过 程 中，还 原 型 谷 胱 甘 肽（Reduced glutathione，GSH）被 DHAR 催化形成氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione，GSSG）。GSSG可以通过谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase，GR），在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（还原型辅酶II，Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的推动下被还原为 GSH，AsA-GSH循环是实现维生素C再生的途径（图1）。3植物果实中维生素C合成途径关键基因表达调控研究在果实维生素C的4个合成代谢途径中，已研究发现 16 个代谢基因：PMI、PMM、GMP、GME、GGP、GPP、GalDH、GLDH、GalUR、MIOX、GulLO、MDHAR、DHAR、AO、APX、GR。3.1L-半乳糖途径代谢基因研究Suekawa等12对樱桃（Malpighia glabra L.）果实中L-半乳糖途径合成维生素C的研究发现，MgGME基因过表达对维生素C含量影响最小，MgGMP或MgGGP过表达对维生素C含量有增加的趋势。而MgGMP和MgGGP共过表达后的维生素C含量高于 MgGMP或 MgGGP单独过表达后的维生素 C含量。此外，GMP、GME和GGP同时多表达的维生素C含量进一步增加，GMP、GME和GGP的多重表达促进了维生素 C 的生物合成。相反，下游的GPP、GalDH和GLDH同时多重表达对维生素C含量没有明显影响，表明由3种下游酶介导的反应不会限制维生素C合成。该通路中多种酶的高基因表达，特别是3种上游酶，对于维生素C的高积累至关重要。一氧化氮（NO）处理的辣椒果实通过上调GMP、GME、GGP、GPP 和 GalLDH 来刺激 L-半乳糖途径，表明NO处理能够通过诱导维生素C的过量合成来改善抗氧化状态。NO处理的辣椒果实不仅使维生素C含量增加了40%，而且还提高了GSH水平以及GalLDH和APX酶的活性22-23。NO处理是一种很有前途的替代方法，凭借维生素C对果实进行生物强化来提高果实采后质量。GME不仅催化GDP-甘露糖转化为GDP-L-半乳糖，还催化GDP-L-古洛糖，被认为是L-古洛糖途径存在的关键证据。在猕猴桃和蓝莓中，果实发 97中 国 野 生 植 物 资 源第 43 卷育过程中GME表达水平与维生素C含量存在显著相关性24。GPP最早从猕猴桃中分离出来，GPP蛋白以二聚体的形式存在于维生素C含量高的猕猴桃中25。当GPP基因被抑制时，可以检测到维生素C含量和GPP活性，表明存在其他维生素C合成途径或其他具有GPP样催化活性的酶。因此，GPP的转录调控在调节维生素C的合成和积累中起着重要作用24。在所有与维生素C合成相关的酶中，GalDH是唯一一种参与维生素C合成但不参与任何其他生物化学反应的酶。尽管GalDH基因已从猕猴桃25等果树中克隆，但GalDH活性与维生素C积累之间的关系尚未明确报道。GLDH是参与 L-半乳糖途径合成维生素 C最后一步反应的关键酶。GLDH基因已在多种果实如猕猴桃26中被鉴定。GLDH对L-半乳糖-1，4-内酯具有高度特异性，高浓度的L-半乳糖-1，4-内酯可抑制其酶活性。大量研究证实，GLDH基因和维生素C含量高度相关27，该基因可能被光诱导以调节维生素 C 含量28，通过光诱导表达或直接影响GLDH酶活性的光呼吸依赖性变化23。3.2D-半乳糖醛酸途径代谢基因研究GalUR在猕猴桃不同组织和发育过程中的表达研究表明，GalUR与维生素C含量高度相关，但是不同猕猴桃品种之间GalUR的同源性较低，约为50%60%26。基因在刺梨果实中的表达先上升后下降，在叶片中的表达则是在中前期保持低水平，而在后期快速上升16。尽管 GalUR基因的表达与刺梨中的维生素C含量无关，但在维生素C快速增加的过程中，GalUR基因表达显著上调，此时L-半乳糖途径并不活跃16。3.3肌醇途径代谢基因研究对MIOX基因的正义转基因植株T0代的维生素C含量测定结果表明，过量表达MIOX可以提高番茄果实的维生素C含量，其中叶片和果实的维生素C含量最高的转基因株系分别比对照增加了38%和61%25。有研究报告称，刺梨中的MIOX和维生素C含量之间没有显著相关性24。而有其他研究报告称，当MIOX过表达时，番茄红熟期果实维生素C含量增加，同时果实对干旱胁迫的耐受性增加，MIOX 转基因番茄果实的整体外观、品质和糖度水平也有显著变化29。此外，番茄 SlIMP3表现出与 L-半乳糖1-磷酸和D-肌醇3-磷酸的高亲和力，并在维生素C和肌醇的生物合成中起到双功能酶的作用。SlIMP3的过表达不仅提高了维生素 C和肌醇含量，而且增加了细胞壁厚度，提高了果实硬度，延缓了果实软化，减少了水分损失，延长了保质期30。图1果实维生素C代谢合成途径Fig.1Metabolism and synthesis pathway of AsA in fruits 98第 3 期尹崇鑫，等：植物果实中维生素C合成代谢及其基因表达研究MIOX过表达可能是通过增加总的 MIOX活性，使肌醇途径在叶片和果实中发挥作用，改善了维生素C生物合成途径，从而改变了维生素C含量。3.4维生素C循环代谢基因研究MDHAR广泛存在于植物的各种组织中，如叶绿体，线粒体，过氧化物酶体，胞质等。研究发现，过表达SlMDAR的番茄叶绿体能够提高转基因番茄果实在低温、高温条件下的抗性以及对紫外线胁迫的抗性21。推测 MDHAR 酶活性的增加促进了APX酶活性，从而导致维生素C含量的降低25。侯艳霞等31发现转入DHAR1基因的番茄植株中果实和叶片的维生素C含量分别提高了57%和58%。抗坏血酸氧化酶属于蓝铜氧化酶家族，参与果实中的 AsA-GSH循环。AO以维生素 C为电子供体并将其氧化还原成水。在植物果实生长发育、逆境胁迫应答及各种代谢途径中发挥重要的调控作用32。枸杞中AO的表达量和活性变化趋势表现为正相关，在花中表达量和活性最高，在果实中次之，成熟叶片中最低33。AO的沉默导致甜瓜果实的生长受到抑制，维生素C水平和成熟模式发生改变32。APX在拟南芥已经描述了 8种类型：3种胞质（APX1，APX2，APX6），2种叶绿体类型（基质sAPX，类 囊 体 tAPX）和 3 种 微 粒 体 亚 型（APX3，APX4，APX5）27。APX 能够有效清除逆境胁迫下产生的ROS，从而保护植物免受损害。葡萄APX基因家族在进化过程中具有较高的保守性，且部分APX基因在ABA、PEG、盐害、低温等非生物逆境胁迫应答过程中具有重要功能。APX酶的活性与维生素C含量有很强的相关性34。水果作物似乎比草本作物拥有更多的APX基因家族成员。GR 作为 AsA-GSH 循环中一种重要的氧化还原酶类，广泛参与植物果实生长、发育和响应环境胁迫过程35。果实（如苹果等）上的机械损伤会触发ROS的形成，从而削弱细胞壁，导致收获后的损失。可以通过使用果实防腐剂来刺激果实抗氧化酶活性，从而消除ROS的影响来控制果实收获后的损失。壳聚糖处理能刺激果实伤口NADPH氧化酶和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活性，增加超氧化物阴离子和过氧化氢的形成36。壳聚糖可以在果实伤口处诱导抗氧化酶，如过氧化物酶和过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性，还能增加抗坏血酸过氧化物、MDHAR、DHAR、GR以及底物（主要是维生素C、DHA、GSH）的含量。创伤刺激了ROS或氧化应激的产生，同时可用壳聚糖触发抗氧化系统，以清除ROS并防止果实膜完整性的丧失。使用硫化氢处理低温保存（7）的香蕉37，可使香蕉的 APX、CAT、GR、DHAR、MDHAR 和 SOD活性提高，GSH 和 AsA 浓度提高，同时显著降低DHA 的含量，缓解香蕉果实冷藏期间所受冻害的影响。4展望维生素C是许多植物果实的主要营养成分，具有诸多生物活性，在工业、医药等行业中具有很高的应用价值。研究其代谢通路与关键酶及其编码基因，有助于调控代谢产物合成方向，培育目标成分含量较高的植株，对提高果实品质及产量具有重要的意义。植物果实中的维生素C含量是由复杂的调节机制共同控制下动态平衡的结果。这些调节机制通过启动或阻止维生素C合成代谢、分解代谢、回收及其细胞内和细胞间的运输和分布来协调对生物和非生物环境因子的反应。迄今为止，对维生素C生物合成酶的了解仍然存在不足，同时对植物调节的遗传和生化策略，特别是对维生素C生物合成的研究也较为稀缺分散。因此，为了更深入地了解这些调节过程，在未来的研究中可结合转录组学、基因组学等方法，对相关酶及其编码基因的功能、结构与表达调控等方面进行深入研究，以阐明植物果实维生素C的合成调控与遗传机制，利用基因工程手段，提高植物果实维生素C的产物积累，为筛选高品质果实提供理论依据。参考文献:1 Ifigeneia M，Athanasios K，Stefanos K，et al.Regulation of vitamin C accumulation for improved tomato fruit quality and alleviation of abiotic stress J.Genes，2021，12（5）：694.2 Costantino P，Stefania F，Nunzio D，et al.Vitamin C in plants：From functions to biofortification J.Antioxidants，2019，8（11）：519.3 Mario F，Iraida A，Victoriano V，et al.Vitamin C content in fruits：Biosynthesis and regulation J.Frontiers in Plant Science，2018，9：2006.4 Padh H.Vitamin C：Newer insights into its biochemical functions J.Nutrition Reviews，1991，49（3）：65-70.5 Smirnoff N.Ascorbic acid 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