MS-222对大黄鱼幼鱼麻...织结构及抗氧化酶活性的影响_章霞.pdf
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1、第 38 卷第 2 期大连海洋大学学报Vol38 No22 0 2 3 年 4 月JOUNAL OF DALIAN OCEAN UNIVESITYApr 2 0 2 3DOI:1016535/jcnkidlhyxb2022-158文章编号:2095-1388(2023)02-0267-08MS222 对大黄鱼幼鱼麻醉效果、组织结构及抗氧化酶活性的影响章霞,徐志进*,李伟业,殷小龙,王易帆,陈爽,马雪彬(浙江省舟山市水产研究所,浙江 舟山 316000)摘要:为探究 MS-222 长时间麻醉对大黄鱼(Larimichthys crocea)幼鱼机体的影响,采用不同质量浓度(10、20、30、40
2、、50、60、70 mg/L)的 MS-222,对体质量为(97.979.56)g 的大黄鱼幼鱼进行 24 h 麻醉试验,通过对肝脏、鳃丝和脑的组织形态及超微结构变化进行显微和电镜观察,评估长时间麻醉对幼鱼机体的影响;通过对肝脏抗氧化酶活性和血清皮质醇浓度的检测,分析麻醉对机体抗逆性的影响。结果表明:在(161)条件下,用质量浓度为 40 mg/L 的 MS-222 麻醉时,幼鱼可进入深度镇静期,用 60 70 mg/L的 MS-222 麻醉时,幼鱼可进入深度麻醉期,但用 70 mg/L 的 MS-222 麻醉 24 h 后,幼鱼的复苏率仅为 50%;组织切片观察显示,用 40 mg/L 的
3、MS-222 麻醉 24 h 时,对机体可能存在轻微损伤;生理生化试验显示,用 20 mg/L 的 MS-222 麻醉时,幼鱼血清皮质醇浓度在 1.5 h 时显著上升(P0.05),用 20、40 mg/L的 MS-222 麻醉时,总体上能增强幼鱼肝脏中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力,在清水中复苏 6 h 后,SOD、CAT、GSH-Px 活力基本能恢复至空白组水平。研究表明,40 mg/L 的 MS-222 可作为本试验条件下大黄鱼幼鱼长时间运输的适宜质量浓度。关键词:大黄鱼;MS-222;组织结构;抗氧化酶活中图分类号:S 965.
4、322文献标志码:A大黄鱼(Larimichthys crocea)隶属于鲈形目(Perciformes)石 首 鱼 科(Sciaenidae)黄 鱼 属(Larimichthys),是中国海水养殖经济鱼类之一,养殖产量居中国海水鱼类养殖前列1。大黄鱼体质娇嫩,易受惊吓,常在养殖操作、养殖运输和商品运输过程中出现应激反应,亦常出现充血、掉鳞和受伤等现象,进而引发疾病甚至死亡,造成巨大的经济损失,这也是制约大黄鱼生鲜产业发展的重要原因2-3。因此,采用鱼用麻醉剂是抑制鱼类过度应激、有效避免损伤的重用手段。烷基磺酸盐同位氨基苯甲酸乙酯(MS-222)具有易溶于水、使用浓度低、入静快、作用时间长和复
5、苏快等特点,被世界各国广泛应用于各种鱼类的麻醉运输和日常养殖操作4-5。研究表明,体质量为 2.53.0 g 的长江刀鲚(Coilia nasus)幼鱼在(25.00.5)水温下,理想的 MS-222 麻醉质量浓度为 150 mg/L6;体质量为(5.590.29)g 的岩原鲤(Procypris rabaudi)幼鱼在 2324 的水温下,MS-222 有效麻醉质量浓度为 120220 mg/L7;体质量为(13010)g 的大口黑鲈(Micropterussalmoides)幼鱼在(28.00.5)水温下,MS-222的最适麻醉质量浓度为 70 mg/L8,MS-222 的麻醉效果被广泛认
6、可。有关 MS-222 对大黄鱼的麻醉效果已有一些研究,如体质量为 450 550 g 的大黄鱼,MS-222 有效麻醉质量浓度为 50 60 mg/L,16 条 件 下 麻 醉 效 果 最 稳 定9;体 质 量 为(250.5215.30)g 的大黄鱼,在 15 条件下,用40 mg/L 的 MS-222 进行麻醉模拟运输 24 h 后,复苏率可达 90%10。但这些研究均是围绕大规格大黄鱼开展的相关麻醉研究,而针对小规格大黄鱼的相关研究并未见报道。而在实际养殖生产中,幼鱼运输、标记和科学研究时麻醉剂使用频繁,为降低损耗并科学应用,有针对性地开展幼鱼时期的麻醉效果研究具有重要意义。收稿日期:
7、2022-05-16基金项目:浙江省基础公益研究计划项目(LGN22C190011);2022 年度第一批市级现代渔业发展专项资金(舟财农 202215 号);浙江省农业(水产)新品种选育重大科技专项(2021C02069-1-4);市级公益类科技项目(2021C31024)作者简介:章霞(1989),女,工程师。E-mail:yufan414515 通信作者:徐志进(1979),男,高级工程师。E-mail:33853377 本试验中,对大黄鱼幼鱼采用不同质量浓度的MS-222 长时间静水麻醉,研究其对大黄鱼幼鱼机体的影响,并确定 MS-222 长时间静水麻醉幼鱼的有效剂量,以期为大黄鱼幼鱼
8、长时间保活运输提供科学参考。1材料与方法1.1材料试验用大黄鱼幼鱼体长为(18.010.82)cm,体质量为(97.979.56)g,由浙江省舟山市水产研究所朱家尖养殖基地提供,试验鱼体质健康、规格相近。试验前于玻璃钢养殖桶(400 L)中暂养1 d。试验用水为无污染的清澈海水,pH 为 7.99,盐度为 201,水温为(161)。试验用玻璃钢鱼桶(半径 r=0.40 m,高 H=0.40 m,实际水位 h=0.20 m)水体体积为 100 L。MS-222 购自上海麦克林生化科技有限公司。1.2方法1.2.1麻醉试验将 MS-222 溶于水,配成质量浓度为 10、20、30、40、50、60
9、、70 mg/L 的麻醉液。1)麻醉和复苏试验。将停食 24 h 的幼鱼从暂养的玻璃钢养殖桶(400 L)转移到盛有不同质量浓度的 MS-222 麻醉液养殖水体(100 L)中,每桶放 10 尾鱼,鱼水质量比约为1 20,观察鱼体的活动情况,用秒表记录鱼体进入不同麻醉阶段的时间。结合在麻醉剂作用下幼鱼表现出的行为变化,参考张丽等9、魏锁成11 和刘长琳等12 的研究结果,将幼鱼麻醉过程分为 6 期,复苏过程分为 4 期(表 1)。麻醉 24 h 后记录存活率,然后转入相同水温的清水中复苏。表 1麻醉和复苏不同阶段鱼类的行为特征9 Tab.1Behavioural characteristics
10、 of fish at different stages of anesthesia and recovery内容 process分期 stage行为特征 behavioural characteristics麻醉过程anesthesia process第期(正常期)呼吸频率正常(鳃盖振动次数和振幅恒定)第期(轻度镇静期)触觉略失,使其平躺后,鱼能迅速翻身恢复到正常状态第期(深度镇静期)触觉丧失,使其平躺后,鱼能通过挣扎恢复到正常状态第期(轻度麻醉期)平衡略失,侧躺水中,在水中来回荡动第期(麻醉期)平衡丧失,鱼体完全翻倒,在水中来回荡动,鳃盖振动变缓第期(深度麻醉期)鱼体静止,鳃盖振动不连续,
11、偶尔出现咧鳃现象,应立即转入清水中复苏复苏过程recovery process第期鱼体完全翻倒,呼吸恢复,鳃盖开始振动(鱼鳍开始晃动)第期身体部分平衡(鱼体侧躺),运动恢复第期身体完全平衡,触觉恢复第期行为完全正常2)24 h 静水麻醉试验。根据上述试验中麻醉程度、复苏时间及存活率,选择能使幼鱼进入镇静期的两组 MS-222 质量浓度(20.0、40.0 mg/L),以及空白组(0 mg/L)开展长时间(24 h)静水麻醉试验,观察不同麻醉时间对幼鱼机体的影响。每组设 3 桶重复,每桶放 18 尾鱼。麻醉 24 h 后放在清水中复苏 6 h,此时记为30 h。分别在试验的第 1.5、3、6、1
12、2、24、30 h 时从每组取 3 尾鱼,采集其血液、肝脏样品,用于生理生化指标测定。1.2.2理化指标测定将血液样品以4 000 r/min离心 20 min,抽取上清液测定血清中皮质醇浓度;取肝脏样品测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力。所有指标均使用商品化试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)进行测定,采用紫外-可见分光光度计测定其吸光度值。1.2.3组织结构观察1)组织切片观察。用 40 mg/L 的 MS-222 麻醉幼鱼 24 h 后,解剖取其肝脏、鳃丝和脑组织,分别用体积分数为 4%的多聚甲醛固定,再用体积分数为 50%、70%
13、、85%、95%的乙醇和无水乙醇逐级脱水,每级进行 2 h;石蜡包埋后,经过切片、苏木精-伊红(HE)染色、中性树胶封片等步骤,在光学显微镜下观察组织学特征。2)电镜观察。用 40 mg/L 的 MS-222 麻醉幼鱼 24 h 后,解剖取其肝脏、鳃丝和脑组织,分别用体积分数为 2.5%的戊二醛和 1%的锇酸固定,梯度乙醇脱水;用白胶包埋组织,烘干后先进行半薄切片(1 m),定位需观察的位置,随后进行超薄切片(80 nm);用体积分数为 2%的醋酸铀饱和乙醇溶液避光染色 8 min,用体积分数为 70%的乙醇清洗 3 次,用超纯水清洗 3 次;用质量分数为2.6%的枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色
14、8 min,再用862大连海洋大学学报第 38 卷超纯水清洗 3 次,滤纸稍吸干;切片在室温下干燥过夜,用透射电镜(HITACHI HT7800)观察拍照。1.3数据处理试验数据以平均值标准差(meanS.D.)表示,采用 SPSS 17.0 软件对试验数据进行方差分析(one-way ANOVA),用 Duncan 法进行组间多重比较,显著性水平设为 0.05。2结果与分析2.1不同质量浓度的 MS-222 对幼鱼的麻醉和复苏效果不同质量浓度的 MS-222 对大黄鱼幼鱼的麻醉及复苏效果见表 2。从表 2 可见:鱼体最终的麻醉程度随着 MS-222表 2不同浓度 MS-222 对幼鱼的麻醉及
15、复苏效果(n=10)Tab.2Anaesthetic and recovery effects of MS-222 on juvenile at different concentrations(n=10)MS-222 质量浓度/(mgL1)MS-222 concentration进入不同麻醉程度的时间/saverage time for reaching different anaesthesia stages复苏至第期的时间/srecovery to stage time第期第期第期第期第期第期第期第期第期第期存活率/%survivalrate10939160215211100205311
16、111101281710030489841316222100404057310879894153473810050344639691661624198 4 900371531119917572761006027347719934374541 801142 3 413324194110142592577158100701333361332823957995412 531227501524218432311 00711650质量浓度的增加,麻醉时间逐渐缩短;当 MS-222质量浓度为 10、20、30 mg/L 时,幼鱼只能进入轻度镇静期(期),无法进入最终麻醉状态;当MS-222 的质量浓度为
17、40 mg/L 时,幼鱼可进入深度镇 静 期(期);当 MS-222 的 质 量 浓 度 为50 mg/L时,鱼体进入麻醉(期)的时间均大于 5 min;当 MS-222 的质量浓度为 60 mg/L 时,鱼体进入麻醉(期)时间小于 5 min,并能进入深度麻醉期(期),麻醉 24 h 后,该组幼鱼的复苏率仍为 100%;当 MS-222 的质量浓度为70 mg/L时,幼鱼能进入深度麻醉期(期),但麻醉 24 h 后,幼鱼的复苏率仅为 50%。2.2MS-222 长时间麻醉对幼鱼组织结构的影响用 40 mg/L 的 MS-222 麻醉 24 h 时,对大黄鱼幼鱼肝脏、鳃丝和脑组织结构的影响见图
18、 1、图 2。组织切片观察显示:空白组幼鱼肝细胞有少数空泡,但细胞核完整,细胞排列有序(图 1A),而40 mg/L 麻醉组出现肝细胞肿胀,部分肝细胞核溶解、消失,细胞核皱缩,核膜形变,胞浆嗜酸性下降,胞浆内脂质沉积(图1B);空白组幼鱼鳃丝排列整齐(图 1C),而 40 mg/L 麻醉组鳃丝的次级鳃丝远端肿胀,上皮细胞坏死,鳃丝内红细胞聚集,鳃丝膨大,红细胞渗出(图 1D);空白组幼鱼脑组织 神 经 元 细 胞 质 浓 染,神 经 元 细 胞 核 明 显(图 1E),而 40 mg/L 麻醉组脑组织疏松水肿神经元细胞质淡染,神经元细胞核不明显(图 1F)。A空白组肝脏;B40 mg/L 的
19、MS-222 麻醉组肝脏;C空白组鳃丝;D40 mg/L 的 MS-222 麻醉组鳃丝;E空白组脑;F40 mg/L的 MS-222 麻醉组脑。a核膜;b胞浆;c红细胞;d神经元细胞;e神经元细胞核。Aliver in blank group;Bliver in 40 mg/L MS 222 anesthesiagroup;Cgill in blank group;Dgill in 40 mg/L MS 222 anes-thesia group;Ebrain in blank group;Fbrain in 40 mg/L MS222 anesthesia group anuclear me
20、mbrane;bcytoplasm;credblood cell;dneuron;eneuronal nucleus图 1麻醉 24 h 时幼鱼肝脏、鳃丝和脑的组织结构Fig.1Histological structure of liver,gill filament andbrain of juvenile under anesthesia for 24 hours962第 2 期章霞,等:MS-222 对大黄鱼幼鱼麻醉效果、组织结构及抗氧化酶活性的影响组织超微结构观察显示:40 mg/L 的 MS-222麻醉组肝细胞明显水肿,整体呈崩解状态,细胞膜大面积破损、不连续,膜内低电子密度水肿区,
21、胆小管迂曲、扩张;细胞核染色质均匀、局部核周隙增宽,胞内可见较大量脂滴;线粒体轻度肿胀,部分线粒体膜破损,基质外溢,粗面内质网轻度扩张(图 2(a)。鳃丝鳃小片结构变形,局部鳃小片断裂,上皮细胞增生肥大,胞内可见较多脂滴;基底膜厚薄不均一,局部复层化、连续,血管腔狭窄,其中可见较多血细胞,轻度栓塞;内皮细胞局部脱落游离,柱细胞数量减少;泌氯细胞明显水肿,细胞内质网明显扩张、空泡变性(图 2(b)。脑中神经元细胞轻度水肿,细胞膜局部小区域破损、不连续,膜内基质分布均匀;细胞核呈圆形,以常BC胆小管;N细胞核;LD脂滴;M线粒体;E粗面内 质 网;Epc上 皮 细 胞;BM基 底 膜;Cap血 管
22、 腔;Enc内皮细胞;PC柱细胞;CCS泌氯细胞。BCbile canaliculus;Nnucleus;LDlipid droplet;Mmito-chondria;Eroughendoplasmicreticulum;Epcepithelialcell;BMbasement membrane;Capcapillary;Encendothelialcells;PCpillar cell;CCSchloride secreting cells图 2麻醉 24 h 时幼鱼肝脏、鳃丝和脑的超微结构Fig.2Ultrastructure of liver,gill filament and brai
23、nof juvenile fish under anesthesia for 24 hours染色质为主,染色质均匀,线粒体轻度固缩,大多线粒体膜完整;嵴存在,少量线粒体轻度固缩,膜内电子密度高,嵴扩张,粗面内质网未见明显扩张,表面可见核糖体附着(图 2(c)。2.3MS-222 质量浓度和麻醉时间对幼鱼血清皮质醇浓度和肝脏抗氧化酶活力的影响2.3.1皮质醇浓度从图 3 可见:静水中的幼鱼经 MS-222 麻醉处理 24 h 内,20 mg/L 麻醉组幼鱼血清皮质醇浓度大致呈现先增长后下降再增长的趋势,在 1.5 h 内皮质醇浓度迅速上升,且显著高于空白组、40 mg/L 麻醉组(P0.05)
24、;40 mg/L 麻醉组在麻醉期间皮质醇浓度变化趋势与空白组较为一致,波动较小;麻醉期间,空白组及 20、40 mg/L麻醉组皮质醇峰值时间点分别为 24、1.5、24 h,麻醉24 h时,3 个麻醉组的血清皮质醇浓度相近(P0.05);复苏 6 h 后,20、40 mg/L 麻醉组幼鱼血清皮质醇浓度均恢复至空白组水平(P0.05)。标有不同字母者表示相同时间下不同麻醉组间有显著性差异(P 0.05),标有相同字母者表示组间无显著性差异(P 0.05),下同。Means with different letters are significant differences at the same
25、time in different MS-222 groups(P0.05)and the means with thesame letter are not significant differences(P0.05),et sequentia.图 3不同浓度麻醉组幼鱼血清皮质醇浓度的变化Fig.3Changes in serum cortisol concentration of ju-venile under different concentrations of MS-2222.3.2SOD 活力从图 4(a)可见:MS-222 对幼鱼肝脏中的 SOD 有显著性影响,总体上来看,20
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