m6A甲基化对邻苯二甲酸单...小鼠睾丸间质细胞自噬的作用_马慧颖.pdf

宁夏医科大学学报45卷邻苯二甲酸酯类化合物（phthalic acid esters，PAEs）作为增塑剂，常被用在儿童玩具、食品外包装和医疗器械等产品的生产过程中1。在对中国23 个城市水源中邻苯二甲酸酯类物质浓度进行检测时发现，邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯 di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP 的检出率高达87.9%2。在生物体内，DEHP 经过一系列酶促反应形成活性代谢产物邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（mono-2-ethylhexyl phthalate，MEHP），MEHP具有生殖和发育毒性等3，其在生物组织中蓄积时间长达 6 个月，因此 MEHP 的毒性评估不容忽视4。在哺乳动物细胞中，自噬是一种非常保守的机制，自噬可介导受损的细胞成分向溶酶体传递以维持体内平衡5。本课题组前期研究发现，MEHP染毒能够诱导胞质内产生自噬体6。N6-甲基腺嘌呤（m6A）是真核细胞中最丰富的 RNA 甲基化形式，研究7表明，m6A 甲基化在精子发生和胚胎发育中起到了重要的调控作用，m6A 去甲基化酶可影响小鼠睾丸精子的生成8，m6A 甲基化酶缺失导致精子发生相关基因的改变，从而使精原细胞收稿日期：2022-08-03基金项目：宁夏自然科学基金项目（2021AAC03163）；2021 年宁夏医科大学优势学科群建设项目；宁夏医科大学校级科研基金项目（XM2020008）作者简介：马慧颖（1996），女，在读硕士研究生，研究方向：卫生毒理学。E-mail：通信作者：李玲，女，教授，硕士研究生导师，研究方向：环境有害因素与健康。E-mail：m6A 甲基化对邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯诱导小鼠睾丸间质细胞自噬的作用马慧颖1，李玲1，2，3，郭晓英1，德小明1，2，3，李丽萍1，2，3，郝羽1，闫凤梅1（1.宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川750004；2.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川750004；3.生育力保持教育部重点实验室，银川750004）摘要：目的探讨邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯 mono（2-ethylhexyl）phthalate，MEHP 致小鼠睾丸间质（TM-3）细胞自噬中 m6A 甲基化的作用。方法将对数生长期的 TM-3 细胞暴露于浓度梯度（0、5、10、20、40、80 mol L-1）的 m6A 甲基化抑制剂 3-脱氮腺苷（3-Deazaadenosine，DAA）24 h，CCK-8 法检测细胞活力，确定3-脱氮腺苷的染毒剂量后，梯度稀释为对照组（0 mol L-1）、MEHP 低剂量组（200 mol L-1）、MEHP 中剂量组（400 mol L-1）、MEHP 高剂量组（800 mol L-1），将 TM-3 细胞分别暴露于 0、200、400、800 molL-1MEHP，40 molL-1DAA+400 mol L-1MEHP 和 40 mol L-1DAA 染毒组 24 h，光镜下观察 TM-3 细胞形态。CCK-8 法检测细胞存活率；m6A RNA 甲基化定量检测试剂盒检测 m6A 修饰水平；丹酰尸胺（MDC）荧光染色检测自噬形成情况；Western blot 检测 LC3-、LC3-/LC3-和 Beclin-1 的蛋白表达水平。结果与对照组相比，DAA 浓度为 5、10、20、40 mol L-1时，细胞活力均无明显变化（P 均0.05）；DAA 浓度为 80 mol L-1时，细胞活力下降（P0.01）；各 MEHP 染毒组 TM-3 细胞活力和 m6A 甲基化水平均降低（P 均0.01），细胞空隙变大，圆形细胞增多，贴壁细胞的数量明显减少；DAA 组 m6A 甲基化水平较对照组降低（P0.01）；与 MEHP 中剂量组相比，DAA+MEHP 组细胞活力和 m6A 甲基化水平均下降（P 均0.01），细胞发生皱缩，细胞间隔稍有增大。与对照组相比，各 MEHP 染毒组、DAA+MEHP 组和 DAA 处理组 LC3-的蛋白表达水平均升高（P 均0.05），MEHP 低剂量组 MDC 荧光信号强度、LC3-/LC3-和 Beclin-1 的蛋白表达量均无明显变化（P 均0.05）；MEHP 中、高剂量组和 DAA+MEHP 组荧光强度、LC3-/LC3-和 Beclin-1 的表达量均升高（P均0.01）；DAA 组荧光强度和 Beclin-1 的表达水平均升高（P 均0.01），LC3-/LC3-无明显变化（P 均0.05）。DAA+MEHP 组荧光强度和 LC3-/LC3-较 MEHP 中剂量组呈上升趋势（P0.05）。结论MEHP 可能通过降低 RNA 甲基化 m6A 修饰的水平来诱导 TM-3 细胞发生自噬。关键词：m6A 甲基化；邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯；小鼠睾丸间质细胞；自噬中图分类号：R698文献标识码：ADOI：10.16050/ki.issn1674-6309.2023.03.004文章编号：1674-6309（2023）03-0236-07论著第 45 卷3 期2023 年 3 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University2363期分化等功能无法正常进行9。本实验通过加入甲基化抑制剂 3-脱氮腺苷（3-deoxyioden osine，DAA）观察 m6A 甲基化在 MEHP 致小鼠睾丸间质细胞自噬中的作用，为进一步研究 m6A 甲基化在 PAEs中致雄性生殖毒性的作用提供理论依据和研究基础。1材料与方法1.1细胞株、主要仪器与试剂1.1.1细胞株小鼠睾丸间质细胞株（TM-3）（中国科学院细胞库）。1.1.2主要仪器CO2培养箱、发光成像系统、超微量紫外分光光度计（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司），康宁细胞计数仪（上海康宁管理有限公司），细胞成像系统倒置生物显微镜（深圳爱可机械有限公司），高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司），多功能酶标仪（美国珀金埃尔默股份有限公司）。1.1.3试剂 MEHP、DMSO溶剂（美国 Sigma公司），DAA（美国 Cayman Chemical 公司），DMEM、双抗、磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（上海逍鹏生物科技有限公司），胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司），CCK-8 细胞增殖检测试剂盒（上海贝博生物科技有限公司），总 RNA 提取试剂盒（大连宝生物工程有限公司），m6A RNA 甲基化定量检测试剂盒（艾美捷科技有限公司），全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白检测试剂盒、自噬检测试剂盒、化学发光检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司），LC3 和 Beclin-1 抗体（Abcam 公司）。1.2TM-3 细胞培养、染毒液配制及分组复苏 TM-3 细胞，每瓶加入含有 10%胎牛血清、1%双抗的 DMEM 培养基至 4 mL，放置于 37、100%相对湿度、5%CO2的细胞培养箱中，培养2448 h 至细胞铺满培养瓶底 80%，传代 23次，在生长至对数生长期时收集 TM-3 细胞，进行后续相关实验。MEHP 染毒液配制：称取 100 mg MEHP 标准品，加入 1 mL DMSO 将其稀释成浓度为359.27 mmol L-1的 MEHP 溶液，其中 DMSO 终浓度为 0.1%，分装储存于-20 条件下，依照课题组前期实验剂量6，加入无菌培养基，梯度稀释成对照组（0 mol L-1）、MEHP 低剂量组（200 mol L-1）、中剂量组（400 mol L-1）、高剂量组（800 mol L-1）的染毒液，现用现配。DAA 组给予终浓度为 40 mol L-1的 DAA，DAA+MEHP 组给予 40 mol L-1DAA+400 mol L-1MEHP。1.3CCK-8 法检测不同浓度甲基化抑制剂对细胞活力的影响将 TM-3 细胞制成单细胞悬液并进行计数，调整细胞浓度后将细胞接种到 96 孔板中（每孔1104个细胞），在 37、5%CO2和 100%相对湿度的 CO2培养箱中培养 68 h，待细胞贴壁后，加入浓度梯度为 0（DAA 对照组）、5、10、20、40、80 mol L-1的 DAA 继续培养 24 h，避光加入适量的检测液，多功能酶标仪中 37 孵育 0.51 h，检测其吸光度值，计算细胞活力10。1.4光学显微镜下观察 TM-3 细胞形态、CCK-8法检测其存活率将制成单细胞悬液的 TM-3 细胞，按每孔2105个细胞接种到 6 孔板中，待细胞铺满孔底70%80%，分别加入 0、200、400、800 mol L-1的 MEHP，40 mol L-1DAA 和 40 mol L-1DAA+400 mol L-1MEHP 干预 24 h，于光学显微镜下进行观察。加入 CCK-8 检测液在 450 nm波长处检测吸光度值，计算 TM-3 细胞存活率。1.5提取 TM-3 细胞总 RNA 并检测不同组别染毒对 m6A 甲基化水平的影响将处于对数生长期的 TM-3 细胞按每孔 2105个细胞接种到 6 孔板中，待细胞铺满孔板底部 70%80%，每孔加入 2 mL 不同组别的染毒液，继续培养 24 h，按照总 RNA 提取试剂盒说明书操作，提取 TM-3 细胞的总 RNA，随后准备相应数量的 8 联管，使用高效 RNA 结合液将 TM-3细胞总 RNA 结合到孔板上，利用捕捉和检测抗体在多功能酶标仪下检测 450 nm 处的吸光值，并计算 m6A 甲基化水平。m6A（）（ODsample-ODNC）S/（ODPC-ODNC）P 100%，其中 S 为样本 RNA 的质量，P 为阳性对照组 RNA 的质量。1.6丹酰尸胺（MDC）染色检测自噬将 TM-3 细胞以每孔 2104个细胞的浓度接种到 24 孔板中，待细胞铺满孔板底部 80%左右，加入不同组别的染毒液放入培养箱中培养 24 h。洗涤缓冲液洗 2 次，每孔加入 100 L 配制好的MDC 染色液，避光在室温下孵育 2030 min，洗涤缓冲液洗 3 次，荧光显微镜下观察，并对每个组别进行随机拍照，用 Image J 软件分析各组的荧光信号强度。1.7Westernblot检测TM-3细胞相关蛋白表达情况TM-3 细胞经过不同组别染毒 24 h，加入蛋马慧颖，等.m6A 甲基化对邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯诱导小鼠睾丸间质细胞自噬的作用237宁夏医科大学学报45卷白裂解液超声裂解20 min，12 000 r min-1离心5 min，收集上清为 TM-3 细胞的全蛋白，用 BCA试剂盒和多功能酶标仪检测蛋白浓度，配制合适的蛋白上样体系。根据蛋白分子质量进行配胶、电泳、转膜、脱脂奶粉封闭，1PBST 清洗后，加入相应的一抗稀释液（LC3 为 12 000；Beclin-1 为15 000）放在 4 冰箱孵育过夜，使用洗膜液清洗 3 次，在室温下孵育二抗 12 h，洗膜 30 min后配制 ECL 发光液对目的条带进行曝光。应用Image J 软件对目的蛋白进行灰度值分析。1.8统计学方法采用 GraphPad Prism 9 和 SPSS 26.0 软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以均数标准差（xs）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较采用 LSD-t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1不同浓度甲基化抑制剂对 TM-3 细胞活力的影响随着 DAA 浓度的增加，TM-3 细胞活力先增加后降低，当 DAA 浓度为 5、10、20、40 mol L-1时，细胞活性分别为（104.3614.01）%、（101.2611.04）%、（99.24 8.70）%、（97.43 7.49）%，与DAA 对照组相比均无明显变化（P0.05）；当DAA浓度为 80 mol L-1时，细胞活性为（84.945.95）%，较 DAA 对照组降低（P0.01），见图 1。120100806040200020406080100浓度/（mol L-1）细胞活力/%*与 DAA 对照组比较*P0.01。图 1不同浓度 DAA 对TM-3 细胞活力的影响2.2不同染毒方式对 TM-3 细胞形态的影响MEHP 对照组 TM-3 细胞大多为梭形和多边形，细胞间排列较密集，MEHP 染毒组随着剂量加大，各细胞间的空隙变大，圆形细胞变多，贴壁细胞的数量明显减少，DAA+MEHP 组与中剂量MEHP 组相比，细胞发生皱缩，细胞间隔稍有增大，见图 2。A.对照组；B.MEHP 低剂量组；C.MEHP 中剂量组；D.MEHP 高剂量组；E.DAA+MEHP 组；F.DAA 组。图 2不同组别对 TM-3 细胞形态的影响（100，标尺为270 m 处）2.3 不同组别染毒对 TM-3 细胞活力的影响不同组别染毒 24 h 测定其吸光度值，结果显示，与 MEHP 对照组相比，MEHP 低、中、高剂量组和 DAA+MEHP 组 TM-3 细胞活力均下降（P均0.01），与 MEHP 中剂量组相比，MEHP+DAA组细胞活力下降（P0.01），见表 1。表 1不同组别染毒对 TM-3 细胞活力的影响浓度/（mol L-1）OD 值存活率/%MEHP 对照组1.100.06100.000.00MEHP 低剂量组0.970.03*80.462.33*MEHP 中剂量组0.830.05*62.514.06*MEHP 高剂量组0.450.08*35.9210.11*DAA+MEHP 组0.730.03aa60.432.25*aaDAA 组0.970.02aa97.437.49aaF 值63.72371.809P 值0.010.01与对照组比较*P0.05，*P0.01；与 MEHP 中剂量组比较aaP0.01。2.4不同浓度 MEHP 对 TM-3 细胞 RNA 甲基化m6A 修饰的影响TM-3 细胞经过不同浓度 MEHP 处理 24 h，MEHP 组对照，低、中、高剂量总体 m6A 甲基化水平依次为（0.070 70.001 4）%、（0.055 30.000 5）%、（0.042 970.001 8）%和（0.039 50.001 0）%，与MEHP 对照组相比，各组 m6A 修饰水平均降低（P 均0.01），见图 3。2.5甲基化抑制剂对 TM-3 细胞 RNA 甲基化m6A 修饰的影响DAA 组 m6A 修饰水平为（0.038 50.002 2）%，与 MEHP 对照组相比下降（P0.01）；DAA+MEHP组 m6A 修饰水平为（0.024 10.001 6）%，与MEHP2383期中剂量组相比降低（P0.01），如图 4。由于40 mol L-1DAA 在明显降低 TM-3 细胞的 m6A修饰水平的同时对细胞损伤较小，因此后续DAA 的干预剂量为 40 mol L-1。2.6 不同浓度 MEHP 及甲基化抑制剂对 TM-3细胞自噬发生的影响MDC荧光染色结果显示，与对照组相比，MEHP低剂量组荧光信号强度为（26.078.35），两者比较差异无统计学意义（P0.05）；MEHP 中、高剂量组和 DAA 组荧光信号强度分别为（77.968.79）、（127.564.65）和（77.7943.95），与对照组相比增强（P0.01）；DAA+MEHP 组荧光信号强度为（112.032.45），较 MEHP 中剂量组增强（P0.05），见图 5。a.荧光显微镜下（100，170 m）TM-3 细胞 MDC 染色情况；b.各组细胞内 MDC 荧光表达定量分析；A.对照组；B.MEHP 低剂量组；C.MEHP 中剂量组；D.MEHP 高剂量组；E.DAA+MEHP 组；F.DAA 组；与对照组比较*P0.01；与 MEHP 中剂量组比较#P0.01。图 5不同处理条件下 TM-3 细胞 MDC 的荧光强度2.7不同浓度 MEHP 对 TM-3 细胞自噬相关蛋白表达量的影响与对照组相比，MEHP 各染毒组 LC3-的表达量均升高（P0.05），伴随着染毒剂量增大，呈逐渐上升的趋势，MEHP 低剂量组 LC3-/LC3-无明显改变（P0.05），MEHP 中、高剂量组 LC3-/LC3-的比例升高（P0.01）。MEHP低剂量组 Beclin-1 的表达量与对照组相比差异无统计学意义（P0.05），MEHP 中、高剂量组Beclin-1 的表达量较对照组升高（P0.01），见图6。2.8甲基化抑制剂对 TM-3 细胞自噬相关蛋白表达情况的影响不同处理条件 Western blot 结果及定量分析结果显示，与对照组相比，DAA+MEHP 组和 DAA组 LC3-的表达水平均升高（P 均0.01），DAA组 LC3-/LC3-无明显变化（P0.05），DAA+MEHP 组 LC3-/LC3-升高（P0.01）。DAA+MEHP 组和 DAA 组 Beclin-1 的表达水平较对照组均上升（P 均0.01），见图 7。3讨论表观遗传学在内分泌干扰物致人类健康损与对照组比较*P0.01。图 3不同浓度 MEHP 对 TM-3 细胞 m6A 修饰水平的影响A.对照组；B.MEHP 中剂量组；C.MEHP+DAA 组；D.DAA 组；与对照组比较*P0.01；与 MEHP 中剂量组比较aaP0.01。图 4甲基化抑制剂对 TM-3 细胞 m6A 修饰水平的影响m6A 的相对水平/%MEHP 对照组*0.080.060.040.020.00组别ABCD*aa0.080.060.040.020.00m6A 的相对水平/%abABCDEF150100500荧光强度*#*马慧颖，等.m6A 甲基化对邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯诱导小鼠睾丸间质细胞自噬的作用MEHP 低剂量组MEHP 中剂量组MEHP 高剂量组239宁夏医科大学学报45卷害中起着重要的作用11，其中 RNA 甲基化在转录后水平调节基因表达，其作用不容忽视。m6A修饰主要分布在 3 非翻译区域、近终止密码子和长外显子区域12，能够调控 RNA 稳定性、选择性剪接、翻译及核转运等。相关研究13发现，机体暴露于环境污染物后，其 DNA 甲基化水平、DNA羟甲基胞嘧啶、RNA 甲基化水平以及相关调节基因均发生改变。另有研究14表明，在睾丸间质干细胞分化的过程中观察到了 METTL14 降低和ALKBH5 增加，导致睾丸间质细胞中 m6A 甲基化水平降低，自噬增加。自噬是一种将自噬体与溶酶体融合进行降解的分解、代谢过程，以满足细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新15。自噬相关基因，在调节自噬过程中发挥重要作用16，其中 LC3 包括 LC3-和 LC3-两种，两者之间可以互相转换，LC3-定位于自噬体膜，常用来判断细胞的自噬水平17。在哺乳动物中，Beclin-1 是酵母 Atg6 的同源物，其促进形成自噬体膜从而对自噬进行调控18。本实验通过 CCK-8 法检测不同组别染毒 24 h 后TM-3 细胞的存活率，结果显示，随着染毒剂量的增加，TM-3 细胞存活率不断下降，DAA+MEHP组细胞存活率较 MEHP 中剂量组降低。光学显微镜下观察细胞形态，结果显示，对照组 TM-3 细胞大多为梭形和多边形，细胞间排列较紧密，随着MEHP 染毒剂量的加大，细胞间的空隙变大，圆形细胞变多，贴壁细胞的数量减少，DAA+MEHP组 TM-3 细胞发生皱缩，细胞间隔较 MEHP 中剂量组稍有增大。使用 m6A RNA 甲基化定量检测试剂盒检测不同处理条件下 TM-3 细胞 m6A 修饰的水平，结果提示，随着 MEHP 染毒剂量的增加，m6A 修饰水平降低，并且呈现出剂量依赖性趋势；DAA+MEHP 组 m6A 修饰水平与 MEHP 中剂量组相比降低；DAA 组 m6A 修饰水平较对照组下降。既往研究19报道，RNA 甲基化的主要功能是促进 mRNA 代谢以维持细胞自我更新，m6A水平降低与癌症进展和低存活率密切相关，这与本研究结果相互验证。MDC 是一种嗜酸性染色剂，通常用来检测自噬体形成，自噬小体可被染成蓝色20。本实验利用 MDC 染色法在荧光显微镜下观察自噬小体形成，结果显示：对照组荧光信号强度最弱，说明正常的 TM-3 细胞中只有极少数的自噬小体，MEHP 低剂量组与对照组相比，荧光信号强度无明显变化，而 MEHP 中、高剂量组荧光信号强度明显增强；DAA+MEHP 组荧光信号强度较中剂量 MEHP 组呈上升趋势；DAA 组荧光信号强度与对照组相比增强。本课题组前期研究6，21发现，一定剂量 MEHP 染毒可通过 PTEN/AKT 信号通路正向调节小鼠睾丸间质细胞自噬。Liu 等22研究发现，邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯依赖 ROS 通过 Akt1 途径诱导人血管内皮细胞自噬。另有研究23表明，MEHP 的原型 DEHP 导致a.Western blot 检测结果；b.各组蛋白相对表达水平比较；与对照组比较*P0.05，*P0.01。图 6不同浓度 MEHP 对 TM-3 细胞自噬相关蛋白表达量的影响a.Western blot 检测结果；b.各组蛋白相对表达量比较；与对照组比较*P0.05，*P0.05）.At a DAA concentration of 80 mol L-1，cell viability decreased significantly（P0.01）.The viabilityof TM-3 cells and the m6A methylation level in the DAA intervention group were reduced in each MEHP infectiongroup（P all0.01）.The cell voids became larger，round cells increased，and the number of adherent cellsdecreased significantly.The m6A methylation level in DAA group was lower than that in the control group（P0.01）.Compared with the MEHP middle-dose group，the cell viability and m6A methylation level of theDAA+MEHP group was significantly decreased（P all0.01），the cells contracted，and the cell spacing increasedslightly.Compared with the control group，the protein expression levels of LC3-in the MEHP infection group，DAA+MEHP group and DAA treatment group were increased（P all0.05）.The fluorescence intensity，LC3-/LC3-ratio and Beclin-1 expression of the MEHPmiddle and high-dose groups and the DAA+MEHP group were significantly enhanced（P all0.01）.The flu-orescence intensity and expression levels of Beclin-1 increased in the DAA group（P all0.05）.The fluorescence intensity and LC3-/LC3-ratio showed an upward trend compared with the MEHP medium dose group（P0.05）.ConclusionMEHP mayinduce autophagy in TM-3 cells by reducing the level of RNA methylation m6A modification.Key words：m6A methylation；mono-（2-ethylhexyl）phthalate；mouse leydig cells；autophagy242