fliL基因显著影响艰难拟梭菌运动功能及产孢能力_鲍江舰.pdf
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1、 鲍江舰 等/fliL 基因显著影响艰难拟梭菌运动功能及产孢能力 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1578-1595 DOI:10.13345/j.cjb.220765 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目:国家自然科学基金(32170134,32160015,U1812403);贵州省自然科学基金(20201Z067,20191441);贵州医科大学优秀青年人才计划(2022101)This work was supported by the Nationa
2、l Natural Science Foundation of China(32170134,32160015,U1812403),the Guizhou Provincial Natural Science Foundation(20201Z067,20191441),and the Excellent Young Talents Plan of Guizhou Medical University(2022101).*Corresponding authors.E-mail:CUI Guzhen,;HONG Wei, Received:2022-09-24;Accepted:2022-12
3、-06;Published online:2022-12-09 1578 生物工程学报 fliL 基因显著影响艰难拟梭菌运动功能及产孢能力 鲍江舰1,2,杨君仪2,邵瑞瑞2,张婷2,廖健4,程玉梅5,官志忠2,6,齐晓岚2,3,陈峥宏1,洪伟2,3*,崔古贞1*1 贵州医科大学基础医学院 贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室,贵州 贵阳 550004 2 贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室 贵州省医学分子生物学重点实验室,贵州 贵阳 550001 3 省部共建地方病及民族区域性疾病防控协同创新中心,贵州 贵阳 550001 4 贵州医科大学口腔医学院 附属口腔医院,贵州
4、贵阳 550001 5 贵州医科大学附属医院综合 ICU,贵州 贵阳 550001 6 贵州医科大学病理科 贵州医科大学附属医院,贵州 贵阳 550001 鲍江舰,杨君仪,邵瑞瑞,张婷,廖健,程玉梅,官志忠,齐晓岚,陈峥宏,洪伟,崔古贞.fliL 基因显著影响艰难拟梭菌运动功能及产孢能力J.生物工程学报,2023,39(4):1578-1595.BAO Jiangjian,YANG Junyi,SHAO Ruirui,ZHANG Ting,LIAO Jian,CHENG Yumei,GUAN Zhizhong,QI Xiaolan,CHEN Zhenghong,HONG Wei,CUI Guz
5、hen.The fliL gene significantly affects the motility and sporulation abilities of Clostridioides difficileJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1578-1595.摘 要:鞭毛基底体相关 FliL 家族蛋白(flagellar basal body-associated FliL family protein,fliL)基因编码 FliL 蛋白,FliL 是一种与鞭毛基体相结合的单跨膜蛋白。为研究艰难拟梭菌 fliL 基因功能,使用非等
6、长同源臂偶联等位交换(allele-coupled exchange,ACE)方法成功构建了fliL基因缺失(fliL)和回补(:fliL)突变株,研究突变菌株与野生型菌株(CD630)生长曲线、抗生素敏感性、pH 耐受性、运动能力及产孢能力等表型的差异。结果显示,菌株 fliL 生长速率及最大生物量均小于菌株CD630,:fliL 回补菌株生长情况回复至野生型。与 CD630 菌株相比,fliL 对阿莫西林、氨苄青霉素、诺氟沙星的敏感性提高,对卡那霉素、四环素敏感性降低,:fliL 抗生素敏感性部分回复至野生型水平。与 CD630 菌株相比,fliL 游泳运动能力显著降低,:fliL 运动能
7、力超越野生型菌株CD630。相比菌株 CD630,菌株 fliL 在 pH 值为 5 时耐受能力显著提高,在 pH 值为 9 时,耐受能力显著降低。除此之外,fliL 产孢能力较 CD630 显著降低,:fliL 产孢能力部分恢复。以上结果表明,艰难拟梭菌 fliL 基因与其运动能力、抗生素敏感性、环境耐受能力和产孢能力密切相关,可能进一步影响艰难拟梭菌菌株的致病力。医药生物技术 鲍江舰 等/fliL 基因显著影响艰难拟梭菌运动功能及产孢能力 :010-64807509: 1579 关键词:艰难拟梭菌;非等长同源臂偶联等位交换;鞭毛;fliL;突变株表型 The fliL gene signi
8、ficantly affects the motility and sporulation abilities of Clostridioides difficile BAO Jiangjian1,2,YANG Junyi2,SHAO Ruirui2,ZHANG Ting2,LIAO Jian4,CHENG Yumei5,GUAN Zhizhong2,6,QI Xiaolan2,3,CHEN Zhenghong1,HONG Wei2,3*,CUI Guzhen1*1 Key Laboratory of Microbiology and Parasitology of Education Dep
9、artment of Guizhou,School of Basic Medical Science,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,Guizhou,China 2 Key Laboratory of Medical Molecular Biology of Guizhou Province,Key Laboratory of Endemic and Ethnic Diseases,Ministry of Education,Guizhou Medical University,Guiyang 550001,Guizhou,China 3 C
10、ollaborative Innovation Center for Prevention and Control of Endemic and Ethnic Regional Diseases Co-Constructed by the Province and Ministry,Guiyang 550001,Guizhou,China 4 Affiliated Stomatological Hospital,School of Stomatology,Guizhou Medical University,Guiyang 550001,Guizhou,China 5 Department o
11、f Critical Care Medicine,the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550001,Guizhou,China 6 The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Department of Pathology,Guizhou Medical University,Guiyang 550001,Guizhou,China Abstract:Flagella are the main motility structure of Clo
12、stridioides difficile that affects the adhesion,colonization,and virulence of C.difficile in the human gastrointestinal tract.The FliL protein is a single transmembrane protein bound to the flagellar matrix.This study aimed to investigate the effect of the FliL encoding gene flagellar basal body-ass
13、ociated FliL family protein(fliL)on the phenotype of C.difficile.The fliL gene deletion mutant(fliL)and its corresponding complementary strains(:fliL)were constructed using allele-coupled exchange(ACE)and the standard molecular clone method.The differences in physiological properties such as growth
14、profile,antibiotic sensitivity,pH resistance,motility,and spore production ability between the mutant and wild-type strains(CD630)were investigated.The fliL mutant and the:fliL complementary strain were successfully constructed.After comparing the phenotypes of strains CD630,fliL,and:fliL,the result
15、s showed that the growth rate and maximum biomass of fliL mutant decreased than that of CD630.The fliL mutant showed increased sensitivity to amoxicillin,ampicillin,and norfloxacin.Its sensitivity to kanamycin and tetracycline antibiotics decreased,and the antibiotic sensitivity partially returned t
16、o the level of CD630 strain in the:fliL strain.Moreover,the motility was significantly reduced in the fliL mutant.Interestingly,the motility of the:fliL strain significantly increased even when compared to that of the CD630 strain.Furthermore,the pH tolerance of the fliL mutant significantly increas
17、ed or decreased at pH 5 or 9,respectively.Finally,the sporulation ability of fliL mutant reduced considerably compared to the CD630 strain and recovered in the:fliL strain.We conclude that the deletion of the fliL gene significantly reduced the swimming motility of C.difficile,suggesting that the fl
18、iL gene is essential for the motility of C.difficile.The fliL gene deletion significantly reduced spore production,cell growth rate,tolerance to ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1580 different antibiotics,acidity,and alkalinity environments of C.difficile.These physiological
19、characteristics are closely related to the survival advantage in the host intestine,which is correlated with its pathogenicity.Thus,we suggested that the function of the fliL gene is closely related to its motility,colonization,environmental tolerance,and spore production ability,which consequently
20、affects the pathogenicity of C.difficile.Keywords:Clostridioides difficile;allele-coupled exchange(ACE);flagellum;fliL;phenotypes of mutants 艰难拟梭菌是一种严格厌氧、革兰氏阳性产芽孢杆菌1。人类肠道正常菌群可以有效地抑制艰难拟梭菌的定殖,但抗菌药物及免疫抑制剂的使用会引起肠道菌群紊乱,导致艰难拟梭菌感染(Clostridioides difficile infection,CDI)。CDI 可引起腹泻、肠出血、肠穿孔及中毒性巨结肠等症状。近 20 年以来
21、,随着高毒力 NAP1/BI/027 菌株的出现和传播,医院获得性 CDI(hospital acquired CDI,HA-CDI)的病人成倍增长。2000 年至 2017 年北美国家 HA-CDI 导致病人死亡比例由小于 1.5%增长至 4.5%5.7%,在流行期间甚至达到 16.7%。在我国,CDI 的发病率及复发率亦逐年提升1-4。艰难拟梭菌引起的腹泻已逐渐成为抗生素相关性腹泻的主要类型。鞭毛作为艰难拟梭菌主要的运动结构,其介导的运动能力影响着艰难拟梭菌在人体胃肠道的粘附、定殖及其毒力。鞭毛由鞭毛基体、鞭毛钩及鞭毛丝组成,鞭毛基体中包含多个定子单元及一个转子以实现细菌的运动功能。鞭毛基
22、体的转子是由作为中央驱动轴的杆部及各类环状功能结构组成,定子则是作为“能量转换器”将离子通道的跨膜运输能量转换为力矩促进细菌运动5。fliL 基因编码的 FliL 蛋白是一种与鞭毛基体相结合的单跨膜蛋白6。有研究通过断层分析表明在伯氏疏螺旋体中 FliL 蛋白位于转子及定子附近7。大量研究成果表明 FliL 蛋白在不同的菌株中发挥的作用并不完全相同,FliL 蛋白对于新月柄杆 菌(Caulobacter crescentus)和 类 球 红 细 菌(Rhodobacter sphaeroides)的运动是必需的8-9。Attmannspacher 等报道大肠杆菌和沙门氏菌fliL 基因突变株在
23、游泳运动能力上略有降低10。Chawla等在后续的研究中甚至得出了相反的结论即 fliL 基因并不是大肠杆菌运动所必需的结构11。可见,FliL 蛋白的缺失在不同菌株中导致的表型变化并不一致。艰难拟梭菌 fliL 基因对其表型及致病力的影响目前尚不明确,仍需进一步研究。目前各种不同的基因编辑技术被应用于艰难拟梭菌的遗传改造12-14。接合转化在质粒转化时具有避开胞外核酸酶的显著优势,目前接合转化已大量用于艰难拟梭菌的基因编辑,其主要通过性菌毛将遗传物质从供体菌转移给受体菌。DNA 转移至艰难拟梭菌并在菌株内进行稳定复制一直是限制艰难拟梭菌相关研究的难题。2002 年 Purdy 等在艰难拟梭菌
24、CD630 中首次发现 PCD6 质粒,并将促进了该质粒复制的主要功能元件(orfA)成功分离。以orfA 为基础构建的 pMTL9301质粒成功地通过接合转化从大肠杆菌 CA434 菌株转移至艰难拟梭菌中并进行稳定复制15,至此完善了穿梭质粒接合转化至艰难拟梭菌的技术。众多编辑技术中基于尿嘧啶缺陷菌株 pyrE的非等长同源 臂 偶 联等 位 交 换(allele-coupled exchange,ACE)编辑方法由 Heap 等建立,并成功应用于艰难拟梭菌中揭示了细胞壁结合半胱氨酸蛋 鲍江舰 等/fliL 基因显著影响艰难拟梭菌运动功能及产孢能力 :010-64807509: 1581 白酶
25、(cell wall-binding cysteine protease,Cwp84)的功能16-17。其原理在于乳清酸磷酸核糖基转移酶(orotate phosphoribosyl transferase,pyrE)基因缺失时艰难拟梭菌无法从头合成尿嘧啶导致细胞死亡,相反在该基因存在时细菌可以将 5-氟乳清酸(5-fluoroorotic acid,5-FOA)转化成具有毒性的 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)导致菌体死亡18(图 1)。另一方面 ACE 技术通过非等长同源臂等位交换原理可控制同源重组发生顺序,实现对目标基因的可控敲除19。本研究中,我们建立了尿嘧啶从头
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