激光扫描共聚焦显微镜(研究生).ppt

激光扫描共聚焦显微镜(研究生)激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜 （LSCMLSCM）授课内容授课内容 一、一、LSCM的发展与现状的发展与现状二、二、LSCM的成像原理及组成的成像原理及组成三、三、LSCM的使用步骤的使用步骤四、四、LSCMLSCM的基本功能的基本功能 五、五、LSCM在生物医学领域中的应用在生物医学领域中的应用1957年，年，MarvinMinsky提出共聚焦原理；提出共聚焦原理；1978年，年，Brandengoff在高数值孔径透镜装在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜；置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜；1982年，年，BIO-RAD公司第一个推出商品化公司第一个推出商品化激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜；1985年，年，WijnaendtsVanResandt发表了发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章；用的文章；1987年，发展成现在通常意义上的第一代激年，发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。光扫描共聚焦显微镜。一、激光扫描共聚焦显微镜发展与现状一、激光扫描共聚焦显微镜发展与现状仪器名称仪器名称仪器名称仪器名称生产商生产商生产商生产商型号型号型号型号BD高通量活细胞共聚焦分析系统400系列美国BD公司Pathway415、Pathway435BD 高通量活细胞共聚焦分析系统800系列美国BD公司800系列BD全光谱活细胞共聚焦高速扫描系统美国BD公司CARV尼康共焦显微镜尼康（Nikon)C1共焦激光扫描显微镜徕卡仪器有限公司 LeicaTCS-SP2OLYMPUS激光共聚焦显微镜OLYMPUSFV300OLYMPUS激光共聚焦显微镜OLYMPUSFV1000NIKON共聚焦显微镜尼康（nikon)尼康（nikon）C1-plusUltraView高速扫描型激光共聚集系统PerkinElmerUltraView高通量共聚焦显徽细胞图像分析测定系统GE HealthcareIN Cell Analyzer 3000时间分辨激光共聚焦显微成像系统德国耶莱公司TauMap德国ZEISS激光共聚焦显微镜德国 ZEISSLSM 510 SYSTEM德国ZEISS激光共聚焦显微镜德国ZEISSLSM 510 PASCAL SYSTEMFluoViewFluoViewFV1000FV1000共聚焦显微镜共聚焦显微镜共聚焦显微镜共聚焦显微镜FV1000FV1000系统完美地整合系统完美地整合系统完美地整合系统完美地整合了两套相互独立的扫描模了两套相互独立的扫描模了两套相互独立的扫描模了两套相互独立的扫描模块在一套系统内，在一束块在一套系统内，在一束块在一套系统内，在一束块在一套系统内，在一束激光进行实验刺激的同时，激光进行实验刺激的同时，激光进行实验刺激的同时，激光进行实验刺激的同时，另一束激光实时地对样品另一束激光实时地对样品另一束激光实时地对样品另一束激光实时地对样品进行扫描，从而记录完整进行扫描，从而记录完整进行扫描，从而记录完整进行扫描，从而记录完整的动态变化过程。的动态变化过程。的动态变化过程。的动态变化过程。美国美国美国美国MeridianMeridian公司的公司的公司的公司的ACASuLTIMA312ACASuLTIMA312为同类仪器中档次为同类仪器中档次为同类仪器中档次为同类仪器中档次最高、功能最全的精密仪器。最高、功能最全的精密仪器。最高、功能最全的精密仪器。最高、功能最全的精密仪器。它能达到每秒它能达到每秒它能达到每秒它能达到每秒120120幅画面的高速幅画面的高速幅画面的高速幅画面的高速扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真彩色的激光共聚焦原色扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真彩色的激光共聚焦原色扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真彩色的激光共聚焦原色扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真彩色的激光共聚焦原色图象。图象。图象。图象。BIO-RADBIO-RAD公司第七代公司第七代公司第七代公司第七代RadianceRadiance 21002100型激光扫描共聚焦显型激光扫描共聚焦显型激光扫描共聚焦显型激光扫描共聚焦显微镜是全世界唯一无需人工调整的激光扫描共聚焦扫描显微镜微镜是全世界唯一无需人工调整的激光扫描共聚焦扫描显微镜微镜是全世界唯一无需人工调整的激光扫描共聚焦扫描显微镜微镜是全世界唯一无需人工调整的激光扫描共聚焦扫描显微镜1 1）激光光源）激光光源）激光光源）激光光源 2 2）计算机系统）计算机系统）计算机系统）计算机系统 3 3）共聚焦系统）共聚焦系统）共聚焦系统）共聚焦系统 4 4）光学探测系统）光学探测系统）光学探测系统）光学探测系统 5 5）图像分辨率）图像分辨率）图像分辨率）图像分辨率 6 6）扫描方式）扫描方式）扫描方式）扫描方式激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统硬件系统硬件系统软件系统软件系统1 1 1 1）、）、）、）、Image AnalyzeImage AnalyzeImage AnalyzeImage Analyze2 2 2 2）、）、）、）、Ratio AnalysisRatio AnalysisRatio AnalysisRatio Analysis和和和和 KineticsKineticsKineticsKinetics3 3 3 3）、）、）、）、Cell Cell Cell Cell Cell Communication and FRAPCell Communication and FRAPCell Communication and FRAPCell Communication and FRAP4 4）、）、）、）、CellListCellList5 5）、）、）、）、CellSortingCellSorting6 6）、）、）、）、ConfocalImagingConfocalImaging激光扫描共聚焦显微镜（激光扫描共聚焦显微镜（激光扫描共聚焦显微镜（激光扫描共聚焦显微镜（LaserScanningConfocalLaserScanningConfocalMicroscopyMicroscopy，简称，简称，简称，简称LSCMLSCM）是近代生物医学图象仪器）是近代生物医学图象仪器）是近代生物医学图象仪器）是近代生物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+Ca2+、pHpH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化等。已广泛值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化等。已广泛值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化等。已广泛值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化等。已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、定免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、定免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、定免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，成为这些领域量、定时和定位研究具有很大的优越性，成为这些领域量、定时和定位研究具有很大的优越性，成为这些领域量、定时和定位研究具有很大的优越性，成为这些领域新一代强有力的研究工具。新一代强有力的研究工具。新一代强有力的研究工具。新一代强有力的研究工具。二、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成二、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成1、LSCM的基本结构的基本结构 荧光显微镜系统及样品台荧光显微镜系统及样品台 激光光源激光光源激光光源激光光源 扫描器扫描器扫描器扫描器 图象存储及处理系统图象存储及处理系统图象存储及处理系统图象存储及处理系统 计计 算算 机机 控控 制制 系系 统统 控制控制控制控制 共聚焦显微镜与普通光学显微镜的比较共聚焦显微镜与普通光学显微镜的比较计算机数字图象处理分析系统计算机数字图象处理分析系统计算机数字图象处理分析系统计算机数字图象处理分析系统 普通光学显微镜普通光学显微镜普通光学显微镜普通光学显微镜场光源场光源场光源场光源干扰干扰干扰干扰激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜激光光源激光光源激光光源激光光源共轭聚焦原理和装置共轭聚焦原理和装置共轭聚焦原理和装置共轭聚焦原理和装置照相照相照相照相LightMicroscopyAC.elegansEmbryoGatpro-nucleimeetingGstage(beforedividinginto2-cellembryo)DifferentialInterferenceContrast(DIC;Nomarski)LaserScanningConfocalMicroscopy(LSCM)MultiphotonFluorescenceExcitationMicroscopy(MPFE)2、LSCM的工作原理的工作原理激光束激光束 扫描器扫描器 接收器接收器 计算机计算机 载物台的升降载物台的升降“光学切片光学切片”“细胞细胞CT”LSCM组组成成光光路路的的示示意意图图 Beam path in the confocal Beam path in the confocal laser scanning microscopelaser scanning microscope（一）激光光源（一）激光光源（1）、激光谱线、激光谱线（2）、激光器开闭和电压调节、激光器开闭和电压调节（3）、激光强度回馈稳定电路设计、激光强度回馈稳定电路设计（4）、辅助设备）、辅助设备波长（波长（波长（波长（nmnmnmnm）功率功率功率功率(mW)(mW)(mW)(mW)激光器类型激光器类型激光器类型激光器类型 325 325 325 325 1010101030 30 30 30 氦镉氦镉氦镉氦镉(He-Cd)(He-Cd)(He-Cd)(He-Cd)激光激光激光激光 351 351 351 351 300 300 300 300 带紫外的水冷式氩离子激光带紫外的水冷式氩离子激光带紫外的水冷式氩离子激光带紫外的水冷式氩离子激光 364 364 364 364 20 20 20 20 风冷氩离子激光（风冷氩离子激光（风冷氩离子激光（风冷氩离子激光（Ar-ionAr-ionAr-ionAr-ion）442 442 442 442 11 11 11 11 氦镉激光氦镉激光氦镉激光氦镉激光 457457457457514 514 514 514 25 25 25 25 小型氩离子激光小型氩离子激光小型氩离子激光小型氩离子激光 543 543 543 543 1.25 1.25 1.25 1.25 绿氦氖绿氦氖绿氦氖绿氦氖(He-Ne)(He-Ne)(He-Ne)(He-Ne)激光激光激光激光 630 630 630 630 33 33 33 33 外谐振器半导体激光外谐振器半导体激光外谐振器半导体激光外谐振器半导体激光 630 630 630 630 3 3 3 3 碰撞脉冲染料激光碰撞脉冲染料激光碰撞脉冲染料激光碰撞脉冲染料激光 632 632 632 632 3.5 3.5 3.5 3.5 氦氖激光氦氖激光氦氖激光氦氖激光 7007007007001100 1100 1100 1100 2 000 2 000 2 000 2 000 蓝宝石激光蓝宝石激光蓝宝石激光蓝宝石激光 1 152 1 152 1 152 1 152 1 1 1 1 氦氖激光氦氖激光氦氖激光氦氖激光 （二）扫描器（二）扫描器扫描器扫描器针孔光栏（针孔光栏（pinhole）分光镜分光镜发射荧光分色镜发射荧光分色镜检测器检测器1）针孔光栏）针孔光栏 2）分光镜）分光镜 作用作用 位置位置 位置位置 作用作用 3）发射荧光分色镜发射荧光分色镜4）检测器检测器位置位置 作用作用 位置位置 作用作用 扫扫描描装装置置光束扫描光束扫描 台阶扫描台阶扫描 扫描方式扫描方式 原原理理优缺点优缺点扫描系统扫描系统（1 1）、激光扫描系统通过照相通道或荧光通道和显微）、激光扫描系统通过照相通道或荧光通道和显微）、激光扫描系统通过照相通道或荧光通道和显微）、激光扫描系统通过照相通道或荧光通道和显微镜相连，与所接显微镜一体化设计镜相连，与所接显微镜一体化设计镜相连，与所接显微镜一体化设计镜相连，与所接显微镜一体化设计（2 2）、检测器数量）、检测器数量）、检测器数量）、检测器数量（3 3）、共聚焦针孔）、共聚焦针孔）、共聚焦针孔）、共聚焦针孔（4 4）、扫描分辨率及灰度级）、扫描分辨率及灰度级）、扫描分辨率及灰度级）、扫描分辨率及灰度级 （5 5）、连续分光设计系统（或其它光谱分离系统）、连续分光设计系统（或其它光谱分离系统）、连续分光设计系统（或其它光谱分离系统）、连续分光设计系统（或其它光谱分离系统）50-30050-300微米微米微米微米 （6 6）、光谱扫描功能）、光谱扫描功能）、光谱扫描功能）、光谱扫描功能（7 7）、扫描速度及速度调节）、扫描速度及速度调节）、扫描速度及速度调节）、扫描速度及速度调节 （8 8）、扫描方式）、扫描方式）、扫描方式）、扫描方式XYZtXYZt任意组合任意组合任意组合任意组合点扫描点扫描点扫描点扫描线扫描线扫描线扫描线扫描XX扫描扫描扫描扫描平面扫描平面扫描平面扫描平面扫描XYXY、XZXZ扫描扫描扫描扫描xyz,xyztxyz,xyzt扫描扫描扫描扫描局部放大扫描局部放大扫描局部放大扫描局部放大扫描光谱模式下，多通道同时扫描。光谱模式下，多通道同时扫描。光谱模式下，多通道同时扫描。光谱模式下，多通道同时扫描。（9 9）、扫描旋转、光学放大（变倍）、扫描旋转、光学放大（变倍）、扫描旋转、光学放大（变倍）、扫描旋转、光学放大（变倍）（1010）、可即时或延时进行扫描）、可即时或延时进行扫描）、可即时或延时进行扫描）、可即时或延时进行扫描 （1111）、有线和帧方式的多重扫描功能）、有线和帧方式的多重扫描功能）、有线和帧方式的多重扫描功能）、有线和帧方式的多重扫描功能ROI(regionofinterestingROI(regionofinteresting，感兴趣区域），感兴趣区域），感兴趣区域），感兴趣区域）实时（实时（实时（实时（realtimerealtime）显示）显示）显示）显示（1212）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无须很复）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无须很复）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无须很复）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无须很复杂地对仪器参数重新设置杂地对仪器参数重新设置杂地对仪器参数重新设置杂地对仪器参数重新设置（1313）、有记忆功能）、有记忆功能）、有记忆功能）、有记忆功能（1414）、有专用的图象数据库）、有专用的图象数据库）、有专用的图象数据库）、有专用的图象数据库（1515）、系统采用模块化设计，便于整个系统的扩）、系统采用模块化设计，便于整个系统的扩）、系统采用模块化设计，便于整个系统的扩）、系统采用模块化设计，便于整个系统的扩展和升级换代展和升级换代展和升级换代展和升级换代Drosophilaembryo,brain,3DProjection-extendeddepthoffocus“(Prof.Reichert,LaborNeurobiologieUniversityofBasel)（三）光学系统（显微镜）（三）光学系统（显微镜）、倒置荧光万能显微镜、倒置荧光万能显微镜、显微镜上的外接接口、显微镜上的外接接口、荧光显微镜的载物台上装有微量步进马达、荧光显微镜的载物台上装有微量步进马达、荧光镜座要装有防振动装置、荧光镜座要装有防振动装置、装有光路转换装置、装有光路转换装置、配备高数值孔径的油浸或水浸物镜、配备高数值孔径的油浸或水浸物镜、载物台支架和附件的配置、载物台支架和附件的配置(10)、4位显微镜荧光滤色片组，置换方便，覆位显微镜荧光滤色片组，置换方便，覆盖紫外和可见光波长盖紫外和可见光波长、荧光显微镜的参数要与光路系统、计算机、荧光显微镜的参数要与光路系统、计算机控制软件系统相匹配控制软件系统相匹配、汞灯光线的强度可调、汞灯光线的强度可调 荧光源荧光源单光子激励（左），多光子激励（右）单光子激励（左），多光子激励（右）单光子激励（左），多光子激励（右）单光子激励（左），多光子激励（右）激发荧光能量图激发荧光能量图单光子（单光子（单光子（单光子（1 1）单光子（单光子（单光子（单光子（2 2）双光子（双光子（双光子（双光子（2 2）单、双光子激发产生荧光过程的示意图单、双光子激发产生荧光过程的示意图荧光荧光荧光荧光荧光光谱荧光光谱分隔发射的荧光分隔发射的荧光 Separation of fluorescence emissions by Separation of fluorescence emissions by means of dichroic filtersmeans of dichroic filters（四）计算机系统（四）计算机系统控制硬件的软件功能：控制硬件的软件功能：控制电动显微镜；控制电动显微镜；控制电动显微镜；控制电动显微镜；选择激光波长，调节激光强度；选择激光波长，调节激光强度；选择激光波长，调节激光强度；选择激光波长，调节激光强度；拍摄拍摄拍摄拍摄2-52-5维图像；维图像；维图像；维图像；选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光挡片选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光挡片选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光挡片选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光挡片位置。位置。位置。位置。应用软件功能（图象处理、数据分析、生物学应用应用软件功能（图象处理、数据分析、生物学应用等）：等）：多通道叠加，三维重建，旋转，生成多通道叠加，三维重建，旋转，生成多通道叠加，三维重建，旋转，生成多通道叠加，三维重建，旋转，生成AVIAVI文件，文件，文件，文件，AverageAverage拍摄模式提高信噪比；拍摄模式提高信噪比；拍摄模式提高信噪比；拍摄模式提高信噪比；荧光强度动态分析，荧光强度动态分析，荧光强度动态分析，荧光强度动态分析，动态显示，动态显示，动态显示，动态显示，RatioRatio值测量（钙离子等）；值测量（钙离子等）；值测量（钙离子等）；值测量（钙离子等）；FRAP/FLIPFRAP/FLIP；线性光谱拆分，自定义染料光谱数据库，背景扣除；线性光谱拆分，自定义染料光谱数据库，背景扣除；线性光谱拆分，自定义染料光谱数据库，背景扣除；线性光谱拆分，自定义染料光谱数据库，背景扣除；图像调节图像调节图像调节图像调节亮度，对比度，亮度，对比度，亮度，对比度，亮度，对比度，GammaGamma；单个通道分别调；单个通道分别调；单个通道分别调；单个通道分别调节或多个通道同时调节；节或多个通道同时调节；节或多个通道同时调节；节或多个通道同时调节；图像处理：旋转，裁剪，多图像处理：旋转，裁剪，多图像处理：旋转，裁剪，多图像处理：旋转，裁剪，多种滤镜（种滤镜（种滤镜（种滤镜（Kirsh/Laplace/Lowpass/MedianKirsh/Laplace/Lowpass/Median），添加标尺，），添加标尺，），添加标尺，），添加标尺，箭头，文字等；箭头，文字等；箭头，文字等；箭头，文字等；图像分析：直方图，距离，强度，强图像分析：直方图，距离，强度，强图像分析：直方图，距离，强度，强图像分析：直方图，距离，强度，强度断面分布；度断面分布；度断面分布；度断面分布；VBAVBA模块：宏功能，可以录制，编辑，回模块：宏功能，可以录制，编辑，回模块：宏功能，可以录制，编辑，回模块：宏功能，可以录制，编辑，回放，实现自动操作；放，实现自动操作；放，实现自动操作；放，实现自动操作；多种视图：多种视图：多种视图：多种视图：1D1D，2D2D，正交视图，正交视图，正交视图，正交视图，图片叠加等；图片叠加等；图片叠加等；图片叠加等；光谱分析具有多种方式选择，支持盲法光谱分析具有多种方式选择，支持盲法光谱分析具有多种方式选择，支持盲法光谱分析具有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；拆分，方便用户使用；拆分，方便用户使用；拆分，方便用户使用；具有专业的具有专业的具有专业的具有专业的FRAPFRAP（荧光漂白），（荧光漂白），（荧光漂白），（荧光漂白），FRETFRET（荧光能量共振转移）软件包。（荧光能量共振转移）软件包。（荧光能量共振转移）软件包。（荧光能量共振转移）软件包。三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤（一）样品制备（一）样品制备1 1组织组织切片切片切片切片标标本本本本 实验标实验标本要求本要求本要求本要求单层单层，并能很好地，并能很好地，并能很好地，并能很好地贴贴附在附在附在附在样样品池品池品池品池中。所以，中。所以，中。所以，中。所以，组织标组织标本无本无本无本无论论是石蜡切片是石蜡切片是石蜡切片是石蜡切片还还是冰是冰是冰是冰冻冻切片，切片，切片，切片，均均均均为为越薄越好。越薄越好。越薄越好。越薄越好。2 2细细胞胞胞胞标标本本本本 细细胞种胞种胞种胞种类类和和和和纯纯度，度，度，度，细细胞密胞密胞密胞密度和形度和形度和形度和形态态。3 3承承承承载细载细胞的器皿胞的器皿胞的器皿胞的器皿 PetriPetri皿和玻片。皿和玻片。皿和玻片。皿和玻片。（二）荧光探针的选择（二）荧光探针的选择标记生物样品的探针标记生物样品的探针大约大约分为：分为：1）蛋白质、单糖和多糖探针；）蛋白质、单糖和多糖探针；2）细胞器探针；）细胞器探针；3）核酸探针；）核酸探针；4）细胞活性探针；）细胞活性探针；5）膜和受体探针；）膜和受体探针；6）细胞膜电位和细胞内）细胞膜电位和细胞内pH探针；探针；7）金属探针；）金属探针；8）分子的特殊基团结合探针；）分子的特殊基团结合探针；9）其他）其他（4）、按软件要求设置有关参数，进行观察）、按软件要求设置有关参数，进行观察和分析。和分析。（三）仪器使用步骤（三）仪器使用步骤（1）、选择激光器类型）、选择激光器类型（2）、选择相应的滤片）、选择相应的滤片（3）、根据实验目的选择适当软件）、根据实验目的选择适当软件Xy观察模式的图象获得观察模式的图象获得设置染色方法设置染色方法显微镜和扫描的配置显微镜和扫描的配置设置物镜放大率设置物镜放大率设置变焦率为设置变焦率为1x设置所需通道设置所需通道设置最高扫描速度设置最高扫描速度设置设置xy观察模式观察模式执行重复扫描执行重复扫描校正对于确定校正对于确定z位置观察所需复合的各部分条件位置观察所需复合的各部分条件设置观察范围设置观察范围校正图象亮度校正图象亮度设置较低的扫描速度设置较低的扫描速度重新校正图象亮度重新校正图象亮度停止重复扫描停止重复扫描获得获得图象图象图象图象储存图象储存图象1 1）DNADNA用用用用Hoechst33342Hoechst33342标记（蓝），标记（蓝），标记（蓝），标记（蓝），2 2）细胞膜用）细胞膜用）细胞膜用）细胞膜用 NBD-NBD-PCPC染色（绿），染色（绿），染色（绿），染色（绿），3 3）线粒体用）线粒体用）线粒体用）线粒体用MitotrackerMitotracker标记标记标记标记（红）（红）（红）（红）三重荧光染色图谱：活三重荧光染色图谱：活HT细胞细胞1、“更多信号！更多信号！”1）、）、通过减慢扫描速度通过减慢扫描速度2）、）、使用使用“平均平均”方法方法3）、）、增加发射滤镜的带宽增加发射滤镜的带宽4）、）、加大针孔直径；加大针孔直径；注意：光学切片的厚度也会相应地增大。注意：光学切片的厚度也会相应地增大。5）、）、增大激发能（激光功率）；增大激发能（激光功率）；注意：漂白效应、饱和效应和光毒效应。注意：漂白效应、饱和效应和光毒效应。如何改善图像质量如何改善图像质量3、“更可靠！更可靠！”1）、使用多轨）、使用多轨2）、提供预定义配置。）、提供预定义配置。3）、可同时定义和使用任何形状的多个研）、可同时定义和使用任何形状的多个研究区。究区。2、“更多细节！更多细节！”1）、使用较高数值孔径）、使用较高数值孔径(NA)的物镜的物镜2）、增加）、增加“帧大小帧大小”=每条线的像素值每条线的像素值+每每帧的线条数帧的线条数3）、优化扫描焦距）、优化扫描焦距(Z)4）、增加动态范围）、增加动态范围Culturedcells,multiplefluorescenceCulturedcells,multiplefluorescence(Prof.Wunderli-Allenspach,ETHZrich)(Prof.Wunderli-Allenspach,ETHZrich)Cellculture,3DshadowprojectionCellculture,3Dshadowprojection(calculatedbyImaris,BitplaneAG,(calculatedbyImaris,BitplaneAG,Zrich)showingtightjunctions(red)andZrich)showingtightjunctions(red)andcytoskeletonstructures(green)(Prof.cytoskeletonstructures(green)(Prof.Wunderli-Allenspach,ETHZrich)Wunderli-Allenspach,ETHZrich)四、激光扫描共聚焦显微镜的基本功能四、激光扫描共聚焦显微镜的基本功能 主要功能主要功能采集图像采集图像定量测定相定量测定相关参数关参数荧光信号定性荧光信号定性定位观察定位观察（一）采集和处理图像（一）采集和处理图像1 1、无损伤逐层扫描样品采集二维及三维荧光图像、无损伤逐层扫描样品采集二维及三维荧光图像、无损伤逐层扫描样品采集二维及三维荧光图像、无损伤逐层扫描样品采集二维及三维荧光图像LSCMLSCM的成像特点：的成像特点：的成像特点：的成像特点：（1 1）、保持样品的完整性。）、保持样品的完整性。）、保持样品的完整性。）、保持样品的完整性。（2 2）、采集多重（波长）荧光分解及合成（）、采集多重（波长）荧光分解及合成（）、采集多重（波长）荧光分解及合成（）、采集多重（波长）荧光分解及合成（overlayoverlay）图像。）图像。）图像。）图像。（3 3）、所采集的荧光图像比普通荧光显微镜质量好，更利）、所采集的荧光图像比普通荧光显微镜质量好，更利）、所采集的荧光图像比普通荧光显微镜质量好，更利）、所采集的荧光图像比普通荧光显微镜质量好，更利于形态学观察。于形态学观察。于形态学观察。于形态学观察。（4 4）、可以只选择出样品中感兴趣的区域（）、可以只选择出样品中感兴趣的区域（）、可以只选择出样品中感兴趣的区域（）、可以只选择出样品中感兴趣的区域（regionsofregionsofinterestinterest，ROIROI）和深度进行扫描。）和深度进行扫描。）和深度进行扫描。）和深度进行扫描。（5 5）、获取三维重建图像）、获取三维重建图像）、获取三维重建图像）、获取三维重建图像2 2、获取透射光及反射光图像、获取透射光及反射光图像、获取透射光及反射光图像、获取透射光及反射光图像有、无荧光的样品均可以用有、无荧光的样品均可以用有、无荧光的样品均可以用有、无荧光的样品均可以用LSCMLSCM采集到其透射光图像。采集到其透射光图像。采集到其透射光图像。采集到其透射光图像。（二）荧光分子的定性及定位（二）荧光分子的定性及定位1 1、定性鉴定待测荧光物质、定性鉴定待测荧光物质、定性鉴定待测荧光物质、定性鉴定待测荧光物质2 2、荧光信号的定位、荧光信号的定位、荧光信号的定位、荧光信号的定位（1 1）、单荧光定位）、单荧光定位）、单荧光定位）、单荧光定位（2 2）、多重荧光标记共定位）、多重荧光标记共定位）、多重荧光标记共定位）、多重荧光标记共定位（3 3）、荧光与透射光共定位）、荧光与透射光共定位）、荧光与透射光共定位）、荧光与透射光共定位Confocalmicrographofmilkshowingmilkprotein(green),fat(blue),sugarcrystals(black)andcocoasolids(red).Bar=25mm（三）定量测定（三）定量测定LSCMLSCM将所采集的共聚焦图像中的相关信息转化为定将所采集的共聚焦图像中的相关信息转化为定将所采集的共聚焦图像中的相关信息转化为定将所采集的共聚焦图像中的相关信息转化为定量数据，即称之为定量测定。量数据，即称之为定量测定。量数据，即称之为定量测定。量数据，即称之为定量测定。（1 1）图像中的任意区域（或线）的荧光强度。）图像中的任意区域（或线）的荧光强度。）图像中的任意区域（或线）的荧光强度。）图像中的任意区域（或线）的荧光强度。（2 2）荧光强度随着时间、空间和波长的变化曲线）荧光强度随着时间、空间和波长的变化曲线）荧光强度随着时间、空间和波长的变化曲线）荧光强度随着时间、空间和波长的变化曲线和数据。和数据。和数据。和数据。（1 1）图像中的任意区域（或线）的荧光强度）图像中的任意区域（或线）的荧光强度）图像中的任意区域（或线）的荧光强度）图像中的任意区域（或线）的荧光强度（3 3）图像内的几何参数，包括面积、厚度、空间）图像内的几何参数，包括面积、厚度、空间）图像内的几何参数，包括面积、厚度、空间）图像内的几何参数，包括面积、厚度、空间距离、体积等。距离、体积等。距离、体积等。距离、体积等。按照定量测定中是否含有时间控制程（按照定量测定中是否含有时间控制程（按照定量测定中是否含有时间控制程（按照定量测定中是否含有时间控制程（t t），将扫描），将扫描），将扫描），将扫描模式分为模式分为模式分为模式分为动态检测和静态测量动态检测和静态测量动态检测和静态测量动态检测和静态测量。ThefigureshowsCa2+responsetoNAADPuncaginginmatureAsterina pectiniferaoocytesmeasuredwithconfocalmicroscope.（四）（四）LSCM可获取的图像种类可获取的图像种类LSCM将所采集的光学图像分为两种：荧光图将所采集的光学图像分为两种：荧光图像和光镜图像。像和光镜图像。1 1）单独采集荧光和光镜图像；）单独采集荧光和光镜图像；）单独采集荧光和光镜图像；）单独采集荧光和光镜图像；2 2）分通道道同时采集多重荧光图像和透射光图像，）分通道道同时采集多重荧光图像和透射光图像，）分通道道同时采集多重荧光图像和透射光图像，）分通道道同时采集多重荧光图像和透射光图像，通过这些图像相互组合，同时展示在一幅画面上；通过这些图像相互组合，同时展示在一幅画面上；通过这些图像相互组合，同时展示在一幅画面上；通过这些图像相互组合，同时展示在一幅画面上；3 3）按照空间（三维）、时间或波长顺序采集图像，）按照空间（三维）、时间或波长顺序采集图像，）按照空间（三维）、时间或波长顺序采集图像，）按照空间（三维）、时间或波长顺序采集图像，通过这些图像组合则可完成断层扫描、三维重建、时间通过这些图像组合则可完成断层扫描、三维重建、时间通过这些图像组合则可完成断层扫描、三维重建、时间通过这些图像组合则可完成断层扫描、三维重建、时间动态实时检测及波长扫描等功能，从而实现空间分辨、动态实时检测及波长扫描等功能，从而实现空间分辨、动态实时检测及波长扫描等功能，从而实现空间分辨、动态实时检测及波长扫描等功能，从而实现空间分辨、时间分辨和波长分辨。时间分辨和波长分辨。时间分辨和波长分辨。时间分辨和波长分辨。显微观察方式显微观察方式（五）光谱交叉干扰及其消除（五）光谱交叉干扰及其消除两种以上荧光探针之间，如果荧光发射峰很近，两种以上荧光探针之间，如果荧光发射峰很近，两种以上荧光探针之间，如果荧光发射峰很近，两种以上荧光探针之间，如果荧光发射峰很近，荧光光谱彼此会有部分重叠，这种现象称谓光谱交叉荧光光谱彼此会有部分重叠，这种现象称谓光谱交叉荧光光谱彼此会有部分重叠，这种现象称谓光谱交叉荧光光谱彼此会有部分重叠，这种现象称谓光谱交叉（crosstalkcrosstalk）；一种荧光探针的荧光信号扩散到另一）；一种荧光探针的荧光信号扩散到另一）；一种荧光探针的荧光信号扩散到另一）；一种荧光探针的荧光信号扩散到另一荧光探针的检测通道，造成光谱交叉干扰。荧光探针的检测通道，造成光谱交叉干扰。荧光探针的检测通道，造成光谱交叉干扰。荧光探针的检测通道，造成光谱交叉干扰。避免或排除光谱交叉干扰的方法避免或排除光谱交叉干扰的方法1）、同时使用几种荧光探针时，尽量选择相互、同时使用几种荧光探针时，尽量选择相互之间无光谱交叉的荧光探针。之间无光谱交叉的荧光探针。2）、降低标记荧光强度。（采用降低标记物、降低标记荧光强度。（采用降低标记物浓度、缩短标记时间、调整探针介质等方法）浓度、缩短标记时间、调整探针介质等方法）3）、采用顺序扫描方法克服光谱交叉。、采用顺序扫描方法克服光谱交叉。4）、改变检测仪器条件。）、改变检测仪器条件。5）、）、荧光光谱鉴别法荧光光谱鉴别法DifferentpopulationsofneurofibrillarytanglesarepresentintheCA1regionofthehippocampusinAD