单核细胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失对小鼠毒力和肠道菌群的影响.pdf
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1、单核细胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失对小鼠毒力和肠道菌群的影响牛俊辉1,2,3,李琦1,3,毛福超1,3,钱满1,2,3,贾艳艳1,2,3,丁轲1,2,3,张春杰1,2,3,程相朝1,2,3,廖成水1,2,3(1.河南科技大学动物科技学院功能微生物与畜禽健康实验室,河南洛阳471023;2.河南科技大学洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室,河南洛阳471023;3.河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室,河南洛阳471023)摘要:【目的目的】探究单核细胞增生性李斯特氏菌 Listeria monocytogenes tatD 基因缺失对小鼠 Mus musculus 毒力和肠道
2、菌群的影响,为 tatD 在单核细胞增生性李斯特氏菌与宿主互作中的作用及减毒疫苗研究提供参考。【方法方法】采用 Bliss 法将亲本菌株(LM10403s)、缺失菌株(LM10403statD)和互补菌株(LM10403sCtatD)口服感染小鼠,确定菌株对小鼠的半数致死量(LD50)。LM10403statD 以 1.00105CFU 口服免疫小鼠观察其免疫保护效果。将 40 只 6 周龄雌鼠随机平均分为对照即磷酸缓冲盐溶液组(PBS)、LM10403s 组、LM10403statD 组和 LM10403sCtatD 组,PBS 组小鼠灌胃 200L 无菌 PBS,实验组分别灌胃 200L
3、含 1.00106CFU 的菌液。灌胃 24h 后剖杀各组小鼠,收集肠道内容物,采用IlluminaHiseq 测序技术测定各处理小鼠盲肠样品微生物 16SrRNAV3V4 区序列,并比较分析其微生物群落结构、多样性和信号通路富集。【结果结果】LM10403statD 的 LD50为 8.11107CFU,毒力低于 LM10403s。同时 LM10403statD 口服免疫小鼠后对单核细胞增生性李斯特氏菌亲本菌株的攻毒能提供 80%保护率。Chao1 和 Observedspecies 指数显示:PBS 与 LM10403statD 处理组差异不显著,但 LM10403s 组和 LM10403
4、sCtatD 处理组相比于 PBS 处理组显著下降(P0.05)。在门水平上,LM10403statD 处理组的厚壁菌门 Firmicutes 相对丰度高于 LM10403s 和 LM10403sCtatD 处理组,而在属水平上,乳杆菌属 Lactobacillus 相对丰度高于 LM10403s 和 LM10403sCtatD 处理组。功能预测分析显示:LM10403s 处理组在细胞过程、环境信息处理和新陈代谢等信号通路的富集程度高于 LM10403statD 处理组。【结论结论】tatD 基因缺失后单核细胞增生性李斯特氏菌的毒力降低,并具有一定的免疫保护效果。tatD 基因缺失菌株感染小鼠
5、对肠道菌群失调影响减小,且有益菌增多。图 6 表 1 参 21关键词:tatD 基因;单核细胞增生性李斯特氏菌;毒力;16SrRNA;肠道菌群中图分类号:S811.6文献标志码:A文章编号:2095-0756(2024)01-0161-08EffectoftatDgenedeletionofListeria monocytogenesonvirulenceandgutmicroflorainmiceNIUJunhui1,2,3,LIQi1,3,MAOFuchao1,3,QIANMan1,2,3,JIAYanyan1,2,3,DINGKe1,2,3,ZHANGChunjie1,2,3,CHENG
6、Xiangzhao1,2,3,LIAOChengshui1,2,3(1.LaboratoryofFunctionalMicrobiologyandAnimalHealth,CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471023,Henan,China;2.LuoyangKeyLaboratoryofLiveCarrierBiomaterial and Animal Disease Prevention and Control,Henan University of Scien
7、ce and Technology,Luoyang收稿日期:2022-12-10;修回日期:2023-09-30基金项目:河南省科技攻关项目(182102110061);河南科技大学研究生创新基金项目(CXJJ-2021-KJ07);河南科技大学青年骨干教师培养计划(13450009)作者简介:牛 俊 辉(ORCID:0009-0009-3901-2387),从 事 微 生 物 感 染 与 固 有 免 疫 细 胞 作 用 研 究。E-mail:。通信作者:廖成水(ORCID:0000-0002-8130-2056),副教授,博士,从事微生物感染与固有免疫细胞作用研究。E-mail:浙江农林大学
8、学报,2024,41(1):161168Journal of Zhejiang A&F Universitydoi:10.11833/j.issn.2095-0756.20220758471023,Henan,China;3.The Key Lab of Animal Disease and Public Health,Henan University of Science andTechnology,Luoyang471023,Henan,China)Abstract:Objective This study,with an investigation of the effects of t
9、atD gene deletion in Listeriamonocytogenesonvirulenceandgutmicrobiotainmice(Mus musculus),isaimedtoprovidereferencefortheroleoftatDintheinteractionbetweenL.monocytogenesandthehost,aswellasforthestudyofattenuatedvaccines.MethodFirst,micewereorallyinfectedwithLM10403s,LM10403statDandLM10403sCtatDstrai
10、ns using the Bliss method to determine the strain s median lethal dose(LD50)for mice beforeimmunoprotective effect of LM10403statD was observed in mice immunized with 1.00105 CFU orally.Then,forty 6-week-old female mice were randomly and equally divided into PBS(ck),LM10403s,LM10403statD,andLM10403s
11、CtatDgroups,withthoseintheckgroupgavagedwith200LofsterilePBSandtheonesintheexperimentalgroupgavagedwith200Lofbacterialsolutioncontaining1.00106CFU,respectively.Next,after24hofgavage,themiceineachgroupweredissectedandkilled,withintestinalcontentscollectedbeforeIlluminaHiseqsequencingtechnologywasused
12、todeterminethesequencesofthemicrobial16SrRNAV3V4regionsofthececumsamplesfromeachgroupsothatacomparativeanalysiswasconductedofthestructureofmicrobialcommunities,diversity,andsignalingpathwayenrichment.ResultTheLD50ofLM10403statDwas8.11107CFU,whichwaslessvirulentthanthatoftheparentalstrain.Oralimmuniz
13、ationofmicewithLM10403statDprovided80%protectionagainstL.monocytogenesparentalstraininfection.Chao1andObservedspeciesindicesshowedthatthedifferencebetweenckandLM10403statDgroupwasnotsignificant,butLM10403sandLM10403sCtatDgroupweresignificantlylowercomparedtockgroup(P0.05).Atthephylumlevel,therelativ
14、eabundanceoftheFirmicutesinLM10403statDgroupwashigherthanthatinLM10403sandLM10403sCtatDgroup,andatthegenuslevel,therelativeabundanceofthegenus,LactobacillusinLM10403statDgroupwashigherthanthatinLM10403sandLM10403sCtatDgroupfunctionalpredictionanalysisshowedthatLM10403sgroupinsignalingpathwaysincludi
15、ngcellularprocesses,environmentalinformationprocessing,andmetabolismwasmoreenrichedthantheLM10403statDgroup.ConclusionThedeletionoftatDgenereducedthevirulenceofL.monocytogenesandhadanimmunoprotectiveeffectswhileinfectionofthetatDgenedeletionmutantstraininmicereducedtheeffectonintestinalfloradysbiosi
16、sandincreasedthebeneficialbacteria.Ch,6fig.1tab.21ref.Key words:tatDgene;Listeria monocytogenes;virulence;16SrRNA;gutmicrobiota单核细胞增生性李斯特氏菌 Listeria monocytogenes 是一种重要食源性人畜共患致病菌1,侵入机体后可穿过肠道屏障,经淋巴和血液循环进入肝脏和脾脏,随后到达大脑和胎盘2,引起败血症、脑膜炎以及早产或流产等症状3。单核细胞增生性李斯特氏菌广泛存在于牛奶、蔬菜和动物性食品等供应链中,由其引发的食物中毒病例逐年增多,虽然人类感染单核细
17、胞增生李斯特氏菌发病率相对较低,但一旦感染死亡率可达 30%70%,占食源性病原菌感染死亡的半数以上4。单核细胞增生性李斯特氏菌分泌的胞外蛋白在细菌感染宿主中发挥着重要作用。细菌存在多种分泌系统将效应蛋白转运至胞外,其中双精氨酸转运系统(twinagininetranslocation,Tat)是运输完全折叠蛋白质的一种分泌系统5。双精氨酸转运系统 D(twinagininetranslocationD,TatD)是一种高度保守蛋白,广泛存在于微生物中,可作为一种重要的毒力因子参与修复 DNA、降解胞外诱捕网和诱发细胞程序性凋亡6。伊氏锥虫Trypanosoma evansi 和路氏锥虫 Tr
18、ypanosoma lewisi 可分泌 TatD 蛋白,降解巨噬细胞胞外诱捕网以对抗宿主的固有免疫反应7。毛福超8研究发现:单核细胞增生性李斯特氏菌 TatD 重组蛋白具有核酸酶活性,同时通过重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术获得了 tatD 基因缺失菌株(LM10403statD),但关于单核细胞增生性李斯特氏菌 tatD 基因对动物的毒力和肠道菌群影响仍不清楚。因此,本研究以小162浙江农林大学学报2024 年 2 月 20 日鼠 Mus musculus 为试验动物,将 LM10403statD 口服感染小鼠,观察 tatD 基因缺失后的单核细胞增生性李斯特氏菌对小鼠毒力和肠道菌群多
19、样性的影响,为进一步探究 tatD 基因在单核细胞增生性李斯特氏菌与宿主互作中的具体作用以及减毒疫苗研究提供科学依据。1材料与方法1.1材料单核细胞增生性李斯特氏菌亲本菌株(LM10403s)、缺失菌株(LM10403statD)和互补菌株(LM10403sCtatD)存于洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室,6 周龄雌鼠购自郑州中原动物实验中心。琼脂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。卡那霉素购自金克隆(北京)生物技术有限公司。脑心膜浸出液(BHI)肉汤购自青岛海博生物技术有限公司。粪便基因组 DNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;TksGflexDNAPolymer
20、ase 购自宝日医生物技术(北京)有限公司;DNA 凝胶快速纯化试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。1.2菌株的复苏与培养将单核细胞增生性李斯特氏菌 LM10403s 和 LM10403statD 接种于 BHI 固体培养基上复苏,将LM10403sCtatD 接种于含卡那霉素的 BHI 固体培养基上复苏,37 恒温培养箱中培养 1216h。挑取LM10403s 和 LM10403statD 单个菌落接种于 BHI 肉汤中,挑取 LM10403sCtatD 单个菌落接种于含卡那霉素的 BHI 肉汤中,37 过夜振荡培养备用。1.3菌株对小鼠的毒力测定用无菌生理盐水将新鲜培养的 LM10403
21、s、LM10403statD 和 LM10403sCtatD 洗涤后进行连续10 倍稀释,选取 5 个稀释度的细菌分别给予小鼠口服灌胃,每个稀释度 10 只小鼠,每只 100L,灌胃前 12h 禁食禁水,接种 2h 后正常饲喂。以给予生理盐水的小鼠作为对照,持续观察各处理组小鼠症状直至无小鼠死亡。将死亡小鼠的肝脏无菌接种到 BHI 固体培养基上,用单核细胞增生性李斯特氏菌引物进行 PCR 扩增鉴定。采用 Bliss 法得到菌株对小鼠的半数致死量(LD50)。1.4缺失菌株的免疫保护率测定用无菌生理盐水将新鲜培养的 LM10403statD 洗涤后调整细菌浓度,以 1.00105CFU 的剂量给
22、予小鼠口服灌胃,灌胃前 12h 禁食禁水,接种 2h 后正常饲喂。于首次免疫 7d 后按相同剂量进行第 2 次免疫,第 2 次免疫 7d 后以给予 1.001010CFU 的剂量对小鼠进行亲本菌株的攻毒。随后持续观察直至连续 7d 无小鼠死亡,记录各处理组小鼠症状及死亡情况。以未免疫强毒攻毒组和健康组为对照评价tatD 基因缺失菌株的免疫保护效果。1.5菌株对小鼠肠道菌群的影响1.5.1动物分组与处理将 40 只 6 周龄昆明雌鼠适应性饲养 7d,随机平分为磷酸缓冲盐溶液(PBS)、LM10403s、LM10403statD 和 LM10403sCtatD 处理组。分别灌胃 200L 含 1.
23、00106CFU 的菌液,对照组小鼠灌胃 200L 无菌 PBS,灌胃前 12h 断食,并口服体积分数为 10%的 Na2HCO3中和胃酸。灌胃 24h 后采用颈椎脱臼剖杀小鼠,立即收集肠道内容物。1.5.2小鼠肠道微生物基因组 DNA 提取与高通量测序利用粪便基因组试剂盒提取基因组 DNA,采用质量浓度为 1%的琼脂糖凝胶电泳和 Nanodrop2000 测定 DNA 浓度。以基因组 DNA 为模板,针对细菌V3V4 作为目标区域进行扩增。引物:343F(5-TACGGRAGGCAGCAG-3)和 798R(5-AGGGTATCTAATCCT-3)。琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物,磁珠
24、法纯化 PCR 产物。送往上海欧易生物医学科技有限公司利用 IlluminaHiseq2500(PE250)系统进行高通量测序。1.5.3生物信息学分析高通量测序得到的 4 组小鼠原始图像数据文件经碱基识别,分析转化为原始双端序列。利用 Trimmomatic(v0.35)、FLASH(v1.2.11)、split_libraries(v1.8.0)和 UCHIME(v2.4.2)等软件对原始序列进行质控,得到优质序列。使用 Vsearch(v2.4.2)软件按照 97%的相似度进行操作分类单元(OTU)分类9,并进行 Alpha 和 Beta 多样性分析以及菌群构成分析。比较 4 个处理组小
25、鼠肠道菌群在门和属水平的分布差异。采用 PICRUSt 软件结合京都基因及基因组百科全书(KEGG)分析各组小鼠肠道菌群信号通路富集情况。第 41 卷第 1 期牛俊辉等:单核细胞增生性李斯特氏菌 tatD 基因缺失对小鼠毒力和肠道菌群的影响1631.6统计分析采用 GraphPadPrism(v8.0.1)软件对数据进行差异性检验,显著性水平为 0.05。2结果与分析2.1缺失菌株对小鼠毒力的影响从表 1 可见:小鼠经口服接种不同稀释含量的LM10403s、LM10403statD 和 LM10403sCtatD 后,各组均有小鼠死亡,而无菌生理盐水对照组的小鼠均未发生死亡。PCR 扩增鉴定死
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