RRS1在神经母细胞瘤组织和细胞中的表达及意义.pdf
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1、 :论著 在神经母细胞瘤组织和细胞中的表达及意义张霞刘存周宝琴曹奕侯琳作者单位:青岛,青岛市中心血站(张霞,周宝琴);青岛,青岛大学附属青岛市第三人民医院检验科(刘存);青岛,青岛大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室(曹奕,侯琳)通讯作者:侯琳,:【摘要】目的探究核糖体合成调控因子 ()在神经母细胞瘤组织和细胞中的表达及意义。方法使用 数据库分析 在神经母细胞瘤组织中的表达情况,并分析 高表达与神经母细胞瘤病理指标及预后之间的关联,随后使用 数据库分析 在神经母细胞瘤细胞系中的表达情况。然后运用慢病毒转染技术过表达或敲低 细胞株中 的表达,采用 法、平板克隆实验、流式细胞术和 法检测 对肿
2、瘤细胞增殖、凋亡、周期分布和迁移的影响。结果 和 数据库分析结果显示,基因在 例 组织中高表达(),且其在 高风险组中的表达明显高于中、低风险组();此外,在 细胞系中的表达水平明显高于其在对照细胞中的表达()。临床病理相关性分析结果显示,的表达水平与 患者的年龄、扩增、分期、分期及 患者的死亡(临床回访)()有关;生存分析显示,高表达组 患者的总生存时间()较低表达患者的短()。细胞功能实验结果表明,过表达可促进 细胞株的增殖、周期进程和迁移并抑制细胞凋亡;而 敲低时,实验显示相反的趋势。结论 高表达可能与神经母细胞瘤患者的不良预后相关,其可参与调节神经母细胞瘤细胞的增殖、凋亡、周期进程和迁
3、移。【关键词】核糖体合成调控因子 ;神经母细胞瘤;增殖;凋亡;迁移 ,;,;,:,:【】(),;,(),()中国小儿血液与肿瘤杂志 年 月第 卷第 期 ,(),(),()();()(),【】;神经母细胞瘤(,)是儿童期最常见的颅外实体肿瘤 ,位居儿童恶性肿瘤的第三位 。它起源于交感神经系统的神经嵴干细胞,主要来自肾上腺髓质 ,通常导致肾上腺或交感神经节瘤 。约占所有儿童肿瘤的,却不成比例的导致 的儿童癌症相关死亡 ,是儿童最致命的颅外肿瘤 。自从人类基因组被揭示以来,测序技术取得了巨大进步,测序时间和成本都有所减少,这进一步促进了全球癌症基因组研究的快速发展 。大规模测序及组学的临床应用,可提
4、供肿瘤患者的大量分子数据,将有助于确定新的靶点和治疗方法。本课题组通过高内涵功能组学筛选技术(,)从 数据库癌症测序数据的众多候选基因中,筛出一个影响细胞功能的驱动基因核糖体合成调控因子 (,)。是核糖体生物发生所必需的一种调节蛋白,在真核生物中其功能是保守的 。最早在酵母中发现,其参与了 的核仁定位及其在前核糖体中的组装,缺失导致前 加工和核糖体亚单位组装缺陷 。近年来,研究发现 与人类疾病密切相关 。本研究探讨了 在 肿瘤组织和细胞系中的表达情况及其对 细胞增殖、凋亡、周期进程和迁移的影响,旨在明确 与 致病机制的相关性,为诊断和治疗提供理论基础。材料与方法 数据来源组织测序数据来自儿童肿
5、瘤数据库(),去除临床信息不全样本后包含 例神经母细胞瘤样本。细胞测序数据来自基因表达综合数据库(,),包含 例神经母细胞瘤细胞系和 例对照细胞系。细胞株人 细胞株 细胞系由上海吉凯基因技术有限公司提供。细胞转染 (过表达)慢病毒、(过表达阴性对照)慢病毒、(干扰)慢病毒和 (干扰阴性对照)慢病毒由上海吉凯基因技术有限公司提供;过表达慢病毒载体序列:,干扰慢病毒载体序列:。依据病毒转染手册加入适宜体积转染培养基和慢病毒,感染 ,弃感染培养基换新的完全培养基。实时荧光定量 ()检测细胞的 水平 为内参,反应设置 个复孔。反应体系为 :,(),(),。两步法 反应条件设置为 预变性 ,循环阶段 个
6、循环(变性 ,退火 )。利用 法计算分析 相对表达量。蛋白免疫印迹实验()检测细胞的 蛋白水平按常规方法进行。检测细胞增殖情况慢病毒转染后,将各组细胞接种于 孔板,每孔约 个细胞,每组设置 个复孔,共铺 张板。培养 后开始检测,每孔加入 试剂,反应 ,酶标仪 检测细胞 值,连续监测 。平板克隆实验将各组细胞接种于 孔板中,个 每孔,每组设 个复孔,轻轻转动使细胞均匀分布。放入细胞培养箱中培养 ,当孔中出现肉眼可见克隆时,终止培养。然后,甲醇固定中国小儿血液与肿瘤杂志 年 月第 卷第 期 ,结晶紫染液染色 。细胞凋亡检测转染后第 收集各组细胞,经次洗涤后,用 (美国 公司)染色。然后,混匀液体,
7、流式细胞仪检测(内)。细胞周期检测转染后第 收集的各组细胞,常规处理后,流式细胞仪检测。试验检测细胞迁移能力将转染 的 单细胞悬液加入 小室上室,再向下室加入含 血清的培养基,置于培养箱中培养 (可根据具体实验过程调整时间)。终止实验后,用结晶紫溶液染色,显微镜下计数。统计学方法采用 软件对实验数据进行数据分析及作图。两组数据分析时采用 ;三组数据分析时采用单因素方差分析。样本临床信息分析采用卡方和 精确检验,生存曲线分析采用 软件。表明差异具有统计学意义。结果 数据库 细胞系中 的表达分析为了解 在 细胞系中的表达情况,从 数据库中下载了 数据集。该数据集包含 种对照细胞系和 种 细胞系(见
8、表)。对该数据集进行初步整理,找到 基因的表达矩阵,并将其矩阵数据导入 软件。分析后结果显示,细胞系中 的表达明显高于对照细胞系(图)。表 中的测序样本对照细胞系 细胞系 ()()数据库 组织中 的表达分析为了解 在 组织中的表达情况,下载了 网站整理的源自 ()的基因表达数据()及临床资料。该 数据集中含 例 样本,整理后发现 例 样本的相关临床资料较全可用于后续分析。这 例 样本含低风险组 例,中风险组 例,高风险组 例。用 软件分析 在三组样本中的表达情况,结果表明高风险组中 的表达明显高于中、低风险组(高风险 中风险:;高风险 低风险:),见图 。将整理的 值导入 语言分析软件,依据
9、()和 ()找到最佳 值(图 ),本组数据的最佳 值为 。继续用 软件对两组 样本的生存期进行分析,结果发现 高表达与低表达患者的总生存期存在明显差异(),曲线提示 高表达组 患者的预后差,见图 。图 数据库中 在不同细胞系中的表达情况 数据库 组织 的表达水平与临床病理相关性分析我们整理了 高表达与 低表达两组样本的临床资料,进一步分析了 的表达水平与临床病理指标的关系(表 )。由表 可见,年龄 个月患者的 表达水平明显高于年龄 个月的患者();扩增患者的 表达水平明显高于 未扩增患者(,);已死亡(临床随访)患者的 表达水平明显高于存活患者(,);期患者的 表达水平明显高于非 期患者();
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