RNA结合蛋白ZFP36在心肌细胞缺氧_复氧损伤中的作用及调控机制.pdf
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1、第 卷第期年月西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)J o u r n a l o fX ia nJ i a o t o ngU n i v e r s i ty(M e d i c a l S c i e n c e s)V o l N o M a r 本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版基础研究R N A结合蛋白Z F P 在心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用及调控机制吕果,孙超峰,张皓,李红军,王芳(汉中市中心医院心内科,陕西汉中 ;西安交通大学第一附属医院心血管内科,陕西西安 ;汉中市疾控中心慢病科,陕西汉中
2、 )摘要:目的探讨R NA结合锌指蛋白(Z F P )在缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞损伤和自噬中的作用及分子调控机制.方法H C 大鼠心肌细胞感染Z F P 过表达慢病毒(O E Z F P )或其阴性对照慢病毒(O E Z F P N C)构建稳转细胞株;转染A T G D过表达质粒(O E A T G D)提高A T G D表达.H/R处理诱导心肌细胞损伤;将H C 细胞分为对照组、H/R组、O E Z F P N CH/R组、O E Z F P H/R组、O E A T G D N CH/R组、O E A T G DH/R组、O E Z F P O E A T G D N C H/
3、R组 和O E Z F P O E A T G D H/R组.各 组 细 胞 应 用W e s t e r nb l o t t i n g检测A T G D、B e c l i n、L C 和Z F P 蛋白表达;实时荧光定量P C R(q P C R)检测Z F P 和A T G D mR NA表达;C C K 检测细胞活性;酶联免疫吸附法(E L I S A)检测白介素(I L )和肿瘤坏死因子(T N F )水平;D C F H D A法检测活性氧(R O S)水平;S O D试剂盒检测S O D水平;流式细胞术检测细胞凋亡;细胞免疫荧光检测L C 自噬体;双荧光素酶报告基因实验检测Z
4、 F P 和A T G DmR NA的结合.结果与对照组比较,H/R组中细胞活性降低,I L 和TN F 水平提高,R O S水平升高而S O D水平降低,细胞凋亡增加;A T G D、B e c l i n 蛋白表达上调,同时L C/L C 比值也显著增加;且Z F P 表达上调(P).与O E Z F P N CH/R组比较,O E Z F P H/R组中细胞活性提高,I L 和T N F 水平降低,R O S水平下降而S O D水平升高,细胞凋亡减少,且A T G D、B e c l i n 蛋白表达下调,L C /L C 比值也显著下调(P).与感染O E Z F P N C慢病毒比较
5、,感染O E Z F P 慢病毒降低A T G D UT R报告基因的荧光素酶活性,降低A T G DmR NA稳定性,下调H/R诱导的A T G D mR NA表达(P).与O E A T G DN CH/R组相比,O E A T G DH/R组中的A T G DmR NA和蛋白表达显著上调,且细胞活性降低,I L 和T N F 水平增高,R O S水平升高而S O D水平降低,细胞凋亡增加(P ).与O E Z F P O E A T G DN CH/R组比较,O E Z F P O E A T G DH/R组中细胞活性降低,I L 和T N F 水平增高,R O S水平升高而S O D水
6、平降低,细胞凋亡增加(P).结论Z F P 在H/R诱导的心肌细胞损伤中表达上调,过表达Z F P 抑制了H/R诱导的心肌细胞损伤,并通过调控A T G D抑制自噬,进而抵抗心肌细胞H/R损伤,证明Z F P 是抵抗心肌缺血再灌注损伤的重要调控分子.关键词:心肌缺血再灌注损伤(M I/R I);锌指蛋白(Z F P );自噬;转录后调控;自噬相关蛋白 D(A T G D)中图分类号:R 文献标志码:AD O I:/j d y x b 收稿日期:修回日期:基金项目:汉中市中心医院青年辅助计划资助项目(Y K )S u p p o r t e db yY o u t hS u p p o r tP
7、 r o j e c to fH a n z h o n gC e n t r a lH o s p i t a l(Y K )通信作者:王芳 E m a i l:w f c o m网络出版地址:h t t p s:/l i n k c n k i n e t/u r l i d/R ()T h e r o l ea n dr e g u l a t o r ym e c h a n i s mo fR N Ab i n d i n gp r o t e i nZ F P i nh y p o x i a/r e o x y g e n a t i o n i n j u r yo f c a
8、 r d i o m y o c y t e sL G u o,S UNC h a o f e n g,Z HANG H a o,L IH o n g j u n,WANGF a n g(D e p a r t m e n to fC a r d i o l o g y,H a n z h o n gC e n t r a lH o s p i t a l,H a n z h o n g ;D e p a r t m e n to fC a r d i o v a s c u l a rM e d i c i n e,T h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s
9、 p i t a l o fX ia nJ i a o t o n gU n i v e r s i t y,X ia n ;D e p a r t m e n to fC h r o n i cD i s e a s e,H a n z h o n gC e n t e r f o rD i s e a s eC o n t r o l a n dP r e v e n t i o n,H a n z h o n g ,C h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v eT oe xpl o r et h er o l eo fZ F P i nc a r
10、d i o myo cyt ei nju rya n da u t oph ag yi n d u c e dbyhy po x i a/r e o xy ge n a t i o n(H/R)s oa s t oc l a r i fyi t sm o l e c u l a rr egu l a t o rym e c h a n i s mM e t h o d s H C r a tc a r d i o myo cyt e s西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学
11、版w e r e i n f e c t e dw i t hZ F P o v e r e xpr e s s i ngl e n t i v i r u s(O E Z F P )o r i t sn ega t i v ec o n t r o l l e n t i v i r u s(O E Z F P N C)t oc o n s t r u c t s t a b l ec e l l l i n e s,r e spe c t i v e ly T r a n s f e c t i o no fA T G Do v e r e xpr e s s i o npl a s m
12、i d(O E A T G D)i mpr o v e dt h ee xpr e s s i o no fA T G D Hy po x i a/r e o xy ge n a t i o n(H/R)i n d u c e dmyo c a r d i a lc e l l i nju ry H C c e l l sw e r em a i n lyd i v i d e di n t oc o n t r o lgr o up,H/Rgr o up,O E Z F P N CH/Rgr o up,O E Z F P H/Rgr o up,O E A T G D N CH/Rgr o u
13、p,O E A T G DH/Rgr o up,O E Z F P O E A T G DN CH/Rgr o up,a n dO E Z F P O E A T G DH/Rgr o up T h epr o t e i ne xpr e s s i o n so fA T G D,B e c l i n,L C a n dZ F P i nH C c e l l sw e r ed e t e c t e dbyW e s t e r nb l o t t i ng T h e mRNA l e v e l so f Z F P a n d A T G D i n H C c e l l
14、s w e r e d e t e c t e d byR e a l t i m ef l u o r e s c e n c equ a n t i t a t i v eP C R(qP C R)T h ev i a b i l i tyo fH C c e l l sw a s d e t e c t e dbyC C K a s s ay T h e l e v e l so f i n t e r l e u k i n(I L )a n dt u m o rn e c r o s i s f a c t o r(T N F )i nH C c e l l sw e r ed e
15、t e c t e dbye n zym e l i n k e di mm u n o s o r b e n ta s s ay(E L I S A)R e a c t i v eo xy ge nspe c i e s(RO S)i nH C c e l l sw e r ed e t e c t e dbyD C F H DA m e t h o d S ODd e t e c t i o nk i tw a su s e dt od e t e c tt h e S OD l e v e li n H C c e l l s T h e apopt o s i s o f H C c
16、 e l l s w a s d e t e c t e d byf l o w cyt o m e t ryL C a u t oph ago s o m e s i nH C c e l l sw e r ed e t e c t e dbyc e l l u l a r i mm u n o f l u o r e s c e n c e D u a l l u c i f e r a s e r epo r t e rge n ea s s ayw a su s e dt od e t e c t t h eb i n d i ngo fZ F P a n dA T G DmRNAi
17、nH C c e l l s R e s u l t s C o mpa r e dw i t hc o n t r o lgr o up,H/Rgr o ups h o w e dd e c r e a s e dc e l l v i a b i l i ty,i n c r e a s e dI L a n dT N F l e v e l s,i n c r e a s e dRO S l e v e l sa n dd e c r e a s e dS ODl e v e l s,i n c r e a s e dc e l l apopt o s i s Up r egu l a
18、t e dA T G Da n dB e c l i n pr o t e i ne xpr e s s i o n,i n c r e a s e dL C/L C r a t i o,a sw e l l a supr egu l a t e dZ F P e xpr e s s i o nw e r ef o u n di nH/Rgr o up(a l lP)C o mpa r e dw i t hO E Z F P N CH/Rgr o up,e l e v a t e dc e l lv i a b i l i ty,d e c r e a s e dI L a n dT N F
19、l e v e l s,d e c r e a s e d RO Sl e v e l sa n di n c r e a s e dS ODl e v e l s,r e d u c e dc e l l apopt o s i s(P),a n dd o w n r egu l a t e dA T G Da n dB e c l i n pr o t e i ne xpr e s s i o n,d e c r e a s e dL C/L C r a t i ow e r e s h o w n i nO E Z F P H/Rgr o up(a l lP)C o mpa r e dw
20、 i t h i n f e c t i o nw i t hO E Z F P N Cl e n t i v i r u s,i n f e c t i o nw i t hO E Z F P l e n t i v i r u sd e c r e a s e dt h el u c i f e r a s ea c t i v i tyo fA T G D U T Rr epo r t e rge n e,d e c r e a s e dt h es t a b i l i tyo fA T G DmRNA,a n dd o w n r egu l a t e dt h eH/R i
21、n d u c e dA T G DmRNAe xpr e s s i o n(a l lP)C o mpa r e dw i t hO E A T G DN CH/Rgr o up,O E A T G DH/Rgr o uph a dupr egu l a t e dA T G DmRNAa n dpr o t e i ne xpr e s s i o n,d e c r e a s e dc e l l v i a b i l i ty,i n c r e a s e dI L a n dT N F l e v e l s,i n c r e a s e dRO Sl e v e l s,
22、d e c r e a s e dS ODl e v e l sa n de l e v a t e dc e l l apopt o s i s(a l lP)C o mpa r e dw i t hO E Z F P O E A T G D N CH/Rgr o up,O E Z F P O E A T G DH/Rgr o uph a dd e c r e a s e dc e l lv i a b i l i ty,i n c r e a s e dI L a n dT N F l e v e l s,i n c r e a s e dRO Sl e v e l s,d e c r e
23、 a s e dS O Dl e v e l sa n de l e v a t e dc e l lapopt o s i s(a l lP )C o n c l u s i o nT h ee xpr e s s i o no fZ F P i supr egu l a t e d i nH/R i n d u c e dc a r d i o myo cyt e i nju ry T h eo v e r e xpr e s s i o no fZ F P i n h i b i t sH/R i n d u c e dc a r d i o myo cyt ei nju rya n d
24、a u t oph ag ybyr egu l a t i ngA T G D,t h u sr e s i s t i ngc a r d i o myo cyt eH/Ri nju ry I tpr o v e st h a tZ F P i sa ni mpo r t a n t r egu l a t o rym o l e c u l eaga i n s tM I/R I K E Y WO R D S:myo c a r d i a l i s c h e m i a r epe r f u s i o n i nju ry(M I/R I);Z F P ;a u t oph ag
25、 y;po s t t r a n s f e c t i o nr egu l a t i o n;A T G D心肌梗死(m y o c a r d i a l i n f a r c t i o n,M I)是引发心血管疾病死亡率位居世界首位的重要原因,其主要病理表现为心肌组织长期缺血缺氧.临床上,及时恢复缺血心肌的血流(再灌注)可限制梗死面积,然而,这种再灌注可能导致组织发生不可逆的损伤,称为心肌缺血再灌注损伤(m y o c a r d i a l i s c h e m i a r e p e r f u s i o ni n j u r y,M I/R I).目前尚无有效防治M
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- RNA 结合 蛋白 ZFP36 心肌 细胞 缺氧 损伤 中的 作用 调控 机制
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