致对虾急性肝胰腺坏死病弧菌SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立及应用.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 10 期2023 年 10 月Vol.45,No.10Oct.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202302027致对虾急性肝胰腺坏死病弧菌SYBR Green I 荧光定量PCR方法的建立及应用张明辉1*,安伟1,张海强2(1.上海市水产研究所 上海市水产技术推广站,上海 200433;2.广州嘉检医学检测有限公司,广东 广州 511400)摘要:为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPN
2、D)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据GenBank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同)毒素基因(KU145397),设计qPCR扩增引物,并采用该引物经PCR扩增基因片段,构建重组质粒pMD18-T-PirB并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品进行qPCR扩增,建立标准曲线,并经反应条件优化初步建立了检测该类VpAHPND的SYBR Green I qPCR方法。以白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫及该VpAHPND的基因组DNA为模板,采用本研究建立的SYBR Green Iq
3、PCR方法检测,评估该方法的特异性;以8.3伊101拷贝/滋L8.3伊108拷贝/滋L的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的SYBR Green I qPCR以及常规PCR检测,比较两种方法的敏感性;以3个不同浓度的质粒标准品作为模板,利用该方法分别进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。建立的该qPCR方法的标准曲线显示,各浓度的质粒标准品的拷贝数与其Ct值均呈良好的线性关系,相关系数R2为0.998。特异性试验结果显示,该方法仅能检出VpAHPND,而其他病原均为阴性结果,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的检测限为 83拷贝/滋L,敏感性是水产行业标准常规PCR的1
4、000倍。重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验变异系数分别在0.31%0.81%和2.05%4.34%,重复性好。利用该方法对61株虾源弧菌样品检测,结果显示阳性检出率为29.5%(18/61),阴性样品检测率为70.5%(43/61),与行业标准的常规PCR检测方法结果完全一致,二者的阳性符合率为100%,总符合率为100%。本研究建立了一类致对虾VpAHPND的SYBR Green I qPCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为AHPND的诊断、监测与流行病学调查提供技术支撑。关键词:急性肝胰腺坏死病;SYBR Green I;荧光定量PCR;弧菌中图分类号:S852.6
5、1文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)10-1032-06Development and application of SYBR Green I fluorescentquantitative PCR method for acute hepatopancreatic necrosisdisease due to pathogenicZHANG Ming-hui1*,AN Wei1,ZHENG Hai-qiang2(1.Shanghai Fisheries Research Institute,Shanghai Fisheries Technical Extension St
6、ation,Shanghai 200433,China;2.Amcare Genomics Laboratory Co.Ltd,Guangzhou 511400,China)Abstract:In order to establish a sensitive and specific fluorescent quantitative PCR(qPCR)detection method for a type of收稿日期:2023-02-28基金项目:上海市现代农业产业技术体系沪农科产字(2022)第 5 号作者简介:张明辉(1979-),男,安徽枞阳人,硕士研究生,主要从事水生动物疾病防控技术
7、研究.*通信作者:E-mail:*Corresponding author(VpAHPND)causing acute hepatopancreatic necrosis disease(AHPND),this study designed a qPCR amplification primer basedon thetoxin gene(KU145397)of the VpAHPND(this study used a variant strain of,the same as below.)in GenBank.The recombinant plasmid pMD18-T-PirB wa
8、s constructed by PCR and sequencing as the plasmid standard.Thestandard curve of PCR was established.The SYBR Green I qPCR method for detection of the type of VpAHPNDwas established byoptimizing the reaction conditions.The genomic DNA of white spot syndrome virus,infectious subcutaneous and hematopo
9、ietictissue necrosis virus,shrimp iridovirus,and VpAHPNDwere used as templates for detection by qPCRmethod established in this study to evaluate the specificity of the method.The plasmid standard of 8.3伊101copies/滋L-8.3伊108copies/滋L was used as templates,and the sensitivity of the two methods was co
10、mpared by using the qPCR established in this studyand the conventional PCR.Three plasmid standards with different concentrations were used as templates for intra and inter batchreproducibility experiments to evaluate the repeatability of the method.The standard curve of the established qPCR method s
11、howedthat the copy number of the plasmid standard of each concentration had a good linear relationship with its Ct value,and thecorrelation coefficient R2was 0.998.The specificity test results showed that the method could only detect VpAHPND,but was negativefor other pathogens,indicating strong spec
12、ificity.The sensitivity results showed that the detection limit of this method for plasmidstandard was 83 copies/滋L,and the sensitivity was 1000 times that of the routine PCR in the aquaculture industry.The coefficientof variation in the intra repeatability assay and inter repeatability assay was 0.
13、31%-0.81%and 2.05%-4.34%,respectively,indicating the developed method has good reproducibility.In addition,this method was used to detect 61 clinical samples,theresults showed that the positive detection rate was 29.5%(18/61)and the negative detection rate was 70.5%(43/61),which wascompletely consis
14、tent with that of conventional PCR method of the industry standard,and the positive coincidence rate of twosamples was 100%,and the total coincidence rate was 100%.This study established a SYBR Green I qPCR method for detectionof the type of VpAHPNDin prawn.The method has strong specificity,high sen
15、sitivity and good repeatability,which provides technicalsupport for the diagnosis,monitoring and epidemiological investigation of AHPND.Key words:acute hepatopancreatic necrosis disease;SYBR Green I;fluorescent quantitative RT-PCR;急性肝胰腺坏死病(AHPND)是一种新兴的虾类细菌性疾病,对全球对虾养殖业造成了严重影响。AHPND最初是由一类变异的副溶血性弧菌特定菌株
16、(VpAHPND)引起的,它可以感染并在对虾消化道内定植,释放某种毒素引起虾肝胰腺组织损伤,该类变异株均含6.9伊104bp的pVA质粒,该质粒携带和基因编码的毒素蛋白1。进一步研究发现,携带和基因的pVA质粒可以传播到非致病弧菌中从而获得对对虾的致病性,而自然缺失和基因的弧菌不会致对虾发病,敲除毒素基因后,弧菌变异株则失去了致病性,而回补该基因后,弧菌可再次获得致病性2。因此,推测Pir毒素基因是VpAHPND的主要致病因子。该病主要危害凡纳滨 对 虾()、斑 节 对 虾()和中国对虾()等多个养殖品种,其中对凡纳滨对虾和斑节对虾的死亡率最高。AHPND自2009年在我国南方对虾养殖区暴发以
17、来,该病在越南、泰国、马来西亚、印度、墨西哥等地相继发生3-4,严重影响亚洲及南美洲等众多国家的对虾养殖业的可持续发展。2022年6月农业农村部修订的 一、二、三类动物疫病病种名录 将该病新增为三类动物疫病,提高了对该病的管理防控要求。随着对AHPND监测的不断加强,对该病的检测技术也成为研究热点。因此,本研究针对pVA质粒中毒素基因的保守区设计特异性引物,并经各反应条件的优化建立检测该类VpAHPND的SYBRGreen I荧光定量PCR(qPCR)方法,该方法不仅可以监测到早期感染的致病弧菌,还可以定量分析病原的感染程度,为AHPND的诊断及流行病学调查提供有效的技术支撑。1材料与方法1.
18、1病原急性肝胰腺坏死病弧菌(VpAHPND)(副溶血弧菌变异株)来自上海市某发病的凡纳滨对虾养殖场,并由本实验室分离、鉴定并保存;白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、虾虹彩病毒(SHIV)及肝肠胞虫(EHP)等虾类病原,由本实验室分离及鉴定;临床弧菌样品由张明辉,等.致对虾急性肝胰腺坏死病弧菌 SYBR Green I 荧光定量 PCR 方法的建立及应用第 10 期1033本实验室在上海地区的历年虾类疫病监测及病害诊疗服务工作中分离鉴定,其中包括副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌等共61株。1.2主 要 试 剂PremixTM、MiniBEST Vi
19、ralRNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、TB Green PremixEX及pMD18-T载体均购自TaKaRa公司;PCR产物回收以及质粒抽提试剂盒购自Axygen公司。1.3引物的设计与合成根据NCBI中VpAHPND毒素基因序列(KU145397),利用PrimerExpress软件设计qPCR特异性引物,上游引物Vp-F:5-AGCTAGACGGTGATGAATGGC-3/下 游 引 物 Vp-R:5-TGTAAGAGTCGTTATCAGCCCAC-3,预 期 扩 增片段222 bp;常规PCR引物参照水产行业标准 急性肝胰腺坏死病诊断规程(SC/T 723
20、3-2020)中的引物,序列为 AP4-F:5-TTGAGAATACGGGACGTGGG-3/AP4-R:5-GTTAGTCATGTGAGCACCTTC-3,预期扩增片段230 bp。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.4重 组 质 粒 标 准 品 的 构 建 与 鉴 定利 用RNA/DNA提取试剂盒提取VpAHPND(副溶血弧菌变异株,后同)菌悬液中的总DNA并作为模板,采用Vp-F/R为引物,经PCR扩增基因片段,PCR产物回收纯化后与pMD18-T载体连接,构建重组质粒,并经 PCR和 测 序 鉴 定。正 确 的 重 组 质 粒 命 名 为pMD18-T-PirB。采用
21、BioTek Synergy多功能酶标仪测其浓度,根据公式:拷贝数(拷贝/滋L)=6.02伊1023伊(质粒浓度ng/滋L伊10-9)/DNA长度(bp)伊660,计算重组质粒的拷贝数后作为质粒标准品。1.5SYBR Green I qPCR各反应条件的优化及标准曲线的建立以重组质粒标准品为模板,采用矩阵法对该SYBR Green I qPCR退火温度(59、60、61、62)和引物终浓度(300 滋mol/L、400 滋mol/L、500 滋mol/L、600 滋mol/L)进行优化,确定最适反应条件。将重组质粒标准品pMD18-T-PirB 10倍倍比稀释,以1031086个稀释度为模板,
22、每个稀释度3个重复,按照优化后的反应条件经该qPCR扩增后,绘制该方法的标准曲线。1.6特异性试验利用RNA/DNA提取试剂盒提取WSSV、SHIV、EHP、IHHNV及VpAHPND(副溶血弧菌变异株)的总DNA作为模板,利用本研究建立的SYBR Geeng I qPCR方法检测,每个样品重复3次,同时设置ddH2O作为阴性对照,以评估该方法的特异性。1.7敏感性试验将重组质粒标准品pMD18-T-PirB10倍倍比稀释,以102109稀释度的质粒标准品作为模板,以ddH2O为阴性对照,利用本研究建立的SYBR Geeng I qPCR以及常规PCR(SC/T 7233-2020)扩增,比较
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