脂多糖对妊娠周期小鼠子宫内膜上皮黏膜免疫屏障影响的研究.pdf

第45卷第12 期2023年12 月doi:10.3969/j.issn.1008-0589.202307001脂多糖对妊娠周期小鼠子宫内膜上皮黏膜免疫屏障影响的研究中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary MedicineVol.45,No.12Dec.2023李慧1，李晓琳*，李金龙，刘文君，薛虹!（1.哈尔滨体育学院，黑龙江哈尔滨150 0 0 1；2.东北农业大学，黑龙江哈尔滨150 0 30)摘要：为评估脂多糖(LPS)对子宫内膜免疫屏障的影响，本研究将30 只健康8 周龄雌性小鼠随机均分为对照组LPS(-)和LPS(+)组，适应性饲养3d后，将两组小鼠分别与雄性小鼠(15只/组)合笼，当日计为妊娠0 d，LPS(+)组雌性小鼠从合笼前15d至0 d以LPS灌胃后检测其对小鼠繁殖性能的影响，结果显示，LPS可显著抑制雌性小鼠的受孕率和仔鼠成活率(P0.05)，造成仔鼠生长性能下降，表明本研究采用小鼠作为该研究动物模型具有可行性。进一步分别在妊娠7 d、14 d 和分娩后5 d采集LPS灌服组 LPS(+)和健康对照组 LPS(-)母鼠子宫，采用相应ELISA试剂盒检测子宫内膜主要黏蛋白(Mucins)MUCl、M U C2 和MUC4的含量；采用westernblot检测子宫内膜上皮细胞紧密连接蛋白Claudin、O c c l u d i n、ZO-1、JA M、E-Ca d h e r i n 的表达量。ELISA结果显示：与LPS(-)组相比，妊娠7 d时LPS(+)组母鼠子宫内膜中MUC1，M U C2 和MUC4的含量均极显著减少(P0.01)，妊娠14d时上述指标均显著升高(P0.05)，但妊娠期间LPS(+)组母鼠子宫内膜中MUC1，M U C2 和MUC4的总量均极显著低于LPS(-)组(P0.05)。We s t e r n b l o t 检测结果显示，与LPS(-)组相比，LPS(+)组雌性小鼠子宫中Occludin的表达量在妊娠7 d时显著降低(P0.05)，在妊娠14 d时显著升高(P0.05)；ZO-1的表达量在妊娠7 d时显著升高(P0.05)；JA M 的表达量在妊娠14d时显著降低(P0.05)；E-Ca d h e r i n 的表达量在妊娠7 d、妊娠14d时显著下降(P0.05表示差异不显著，*P0.05表示差异显著，*P0.05)，但其它各项指标LPS(+)组小鼠均极显著低于LPS(-)组小鼠(P0.01)(图1)。表明LPS可显著降低母鼠的繁殖性能，尤其仔鼠的成活率下降趋势较为显著。由于妊娠阶段最重要的器官为母鼠子宫 8，本研究结果证实雌性小鼠可以作为LPS损伤动物生殖系统的实验动物。基于此，本研究后续实验采集母鼠子宫组织样品，分析LPS对其子宫内膜上皮细胞各蛋白的影响。2071507ns*(%)ael 15-(%)率手用10-5-0LPS(+)LPS(-)(%)率胃*(%)a0/u100-50-0LPS(+)LPS(-)2.52.0-(8)重胃1.5-1.0-0.5-0*:P0.05;*:P0.05;the same as below.图1LPS对小鼠繁殖性能的影响Fig.1 Effect of LPS on reproductive performance of mice2.2LPS对子宫内膜黏蛋白表达量影响的ELISA检测结果对采集的各组小鼠各时间点子宫内膜样品采用相应ELISA试剂盒定量检测MUC1、M U C2、3*(uo)斗LPS(+)LPS(-)MUC4的表达水平，结果显示：妊娠7 d时，LPS(+)组小鼠子宫内膜中MUC1、M U C 2、M U C 4的含量极显著低于LPS(-)组(P0.01)，妊娠14 d时，LPS(+)组*(o)aor0LPS(+)LPS(-)1298中国预防兽医学报2023年小鼠子宫内膜上述3种蛋白的含量显著高于LPS(-)组(P0.05)；但妊娠7 d和14 d时，LPS(+)组小鼠子宫内膜上述3种蛋白的总含量均极显著低于LPS(-)组(P0.05)(图2)。子宫内膜屏障的完整性是维持子宫正常功能的基础 9。黏蛋白在雌性生殖道的生殖功能和防御中起重要作用，可以保护子宫内膜免受酶和微生物的攻击，是子宫黏膜屏障的重要组成部分，也是子宫先天免疫的第一道防线 8,10 。子宫内膜黏液层主要成分是由MUC1、M U C2 和MUC4等黏蛋白组成，为覆盖于子宫上皮细胞上的一层黏液组织。本实验通过对子宫黏膜主要成分MUC1、M U C 2 及MUC4的ELISA定量分析发现：妊娠7 d时，LPS可导致子宫内膜中MUC1、M U C 2 和MUC4的含量显著减少，说明LPS在母鼠妊娠7 d破坏了子宫内膜的黏液层结构。妊娠14 d，LPS可导致子宫内膜中MUC1、MUC2和MUC4的含量极显著减少，表明LPS在妊娠A47(Tu/u)InN3-20C0.4-(Tu/Bu)tonN0.3-0.2-0.1-0A：LPS对小鼠子宫内膜中MUC1的影响；B：LPS对小鼠子宫内膜中MUC2的影响；C：LPS对小鼠子宫内膜中MUC4的影响；A:Effects of LPS on MUC1 in mouse endometrium;V:Effects of LPS on MUC2 in mouse endometrium;C:Effects of LPS on MUC4 in mouse endometrium;D:Effects of LPS on total Mucoprotein in mouse endometriumFig.2 Detection of effects of LPS on MUC1,MUC2 and MUC4 in mouse endometrium by ELISA2.3LPS对小鼠子宫紧密连接蛋白影响的westernblot检测结果对收集的各组小鼠各时间点的子宫中后期进一步破坏了子宫内膜的黏液层结构；但分娩后5d，LPS处理组小鼠子宫内膜MUC1、M U C2 和MUC4的含量之间无显著差异，这可能是由于分娩后母鼠体内的LPS可通过母乳进入仔鼠体内，因而减轻了LPS对母鼠子宫的损伤，这也可能是导致仔鼠成活率下降的原因。当子宫受到LPS的刺激首先作用于子宫内膜的黏膜层，使其变薄失去防御能力，LPS可进入子宫内膜上皮细胞，其次LPS进一步作用于子宫内膜上皮细胞，此时子宫组织损伤较为严重，子宫固有层腺细胞通过胞吐作用将糖胺聚糖颗粒分泌到子宫腔中，代偿性增加子宫内膜黏液层的厚度以保护子宫，所以推测妊娠14d时3种黏蛋白的含量的变化可能是由于子宫在受到LPS刺激时防御性反应的结果-13。分娩后5d，LPS对子宫内膜中黏蛋白、紧密连接相关蛋白均无显著影响，此时母鼠泌乳机能亢进，血液中的LPS可能被蓄积于乳腺，通过泌乳排出体外并被仔鼠吸收，后续应该对鼠乳中的LPS含量检测，以验证该推论。*Bns(Tu/au)ZnNPD7PD14*PD7PND：分娩后天数(Post-natal day)；PD：妊娠天数(Pregnancy day):LPS(+);:LPS(-),the same as below.D：LPS对小鼠子宫内膜中(MUC1+MUC2+MUC4)总含量的影响图2 LPS对小鼠子宫内膜中MUC1、M U C 2 及MUC4影响的ELISA检测结果0.870.6-0.40.2-0PND5DnsPD14PND5*PD75*4一(Tu/u)3210内膜样品，利用westernblot检测其中的紧密连接相关蛋白Claudin、O c c lu d i n、ZO-1、JA M 和E-CadherinnsPD14PND5nsPD7PD14PND5第12 期李慧，等。脂多糖对妊娠周期小鼠子宫内膜上皮黏膜免疫屏障影响的研究1299的蛋白表达量。结果显示，妊娠7 d，与LPS(-)组小鼠比较，LPS(+)组小鼠子宫内膜中Claudin及JAM蛋白表达量无显著差异(P0.05)；LPS(+)小鼠子宫内膜中Occludin、E-C a d h e r in 蛋白的表达量极显著低于LPS(-)组(P0.01)；LPS(+)组小鼠子宫内膜中ZO-1蛋白表达量极显著高于LPS(-)组小鼠(P0.01)。妊娠14 d,LPS(+)组小鼠子宫内膜中Claudin及E-Cadherin蛋白的表达量极显著低于LPS(-)组小鼠(P0.01)；妊娠14 dA1.57(Tu/au)uipneio1.0ns0.5-0PD7-actinClaudinLPS+D1.5(Tu/au)Wvr1.0-0.5-0-PD7-actin JAM-LPS+-+-+A：LPS对小鼠子宫内膜Claudin表达的影响；B：LPS对小鼠子宫内膜Occludin表达的影响；C：LPS对小鼠子宫内膜ZO-1表达的影响；D：LPS对小鼠子宫内膜JAM表达的影响；E：LPS对小鼠子宫内膜E-Cadherin表达的影响A:Effects of LPS on the expression of uterine Claudin;V:Effects of LPS on the expression of uterine Occludin;C:Effects of LPS on the expressionof uterine ZO-1;D:Effects of LPS on the expression of uterine JAM;E:Effects of LPS on the expression of uterine E-Cadherin黏液层下的子宫内膜上皮细胞紧密连接，将细胞与细胞之间的间隙封闭，形成上皮细胞屏障，并参与构成子宫上皮物理屏障，紧密连接还在一定程度上抑制脂质和蛋白质的流动，维持上皮细胞的极性以及子宫黏液层和子宫内膜上皮细胞的位置关系 141。本研究结果显示母鼠妊娠7 d时LPS(+)组小鼠子宫内膜中Occludin的表达量显著降低，而ZO-1的表达量则反之。由于ZO-1和Claudin的结合在子宫内膜上皮细胞紧密连接过程中具有重要的作用，因此推测在妊娠7 d时，子宫内膜上皮细胞通过上调ZO-1的表达时，LPS(+)组小鼠子宫内膜中Occludin的表达量与LPS(-)组相比极显著升高(P0.05)；LPS(+)组小鼠子宫内膜中JAM蛋白表达量显著低于LPS(-)组小鼠(P0.05)(图3)。B11.57*(Tu/au)uipnjooonsPD14PND542ku20kuOccludinLPS+nsnsPD14PND542ku32ku图3LPS对小鼠子宫内膜紧密连接蛋白表达影响的westernblot检测结果Fig.3 Detection of effects of LPS on the expression of uterine tight junction protein by western blotC1.07*1.0-0.5-0PD7-actin+-+E1.5*1.0-0.5-0PD7-actinE-CadherinLPS+-+-+量以适应LPS对紧密连接的损害。LPS可使小鼠子宫内膜E-Cadherin的表达量显著降低，E-Cadherin作为参与细胞黏附作用的钙粘素中最重要的成员，在细胞-细胞黏附和维持组织形态结构中起着极其重要的作用，在子宫内E-Cadherin表达的降低是子宫内膜异位症的重要原因-13，因此推测LPS可能通过影响E-Cadherin的表达来干扰子宫内膜上皮细胞的细胞-细胞黏附从而破坏上皮细胞物理屏障。由上述结果可知妊娠7 d时，子宫内膜黏蛋白在LPS的刺激下显著减少，子宫黏液层的防御作用被破坏，使子宫内nsPD14PND542ku-actin59kuZO-1LPS+.+-+*nsPD14PND542ku97ku0.8(Tu/Bu)I-Oz0.60.40.20PD7nsnsPD14PND542ku195ku1300中国预防兽医学报2023年蓄积的有害物质易于异位到子宫上皮细胞，以破坏子宫上皮细胞紧密连接，此时，紧密连接蛋白Oc-cludin与E-Cadherin均受到显著性的破坏。在妊娠14d时LPS可使Claudin的表达量显著下降，而Claudin是紧密连接的骨架蛋白，表明LPS可以通过降低Claudin的表达量来破坏紧密连接的骨架。在妊娠14d时，LPS可使Occludin的表达量显著升高，而在分娩后5d，LPS对Occludin的作用不明显。在LPS作用的早期，细胞间Occludin的相互连接受到破坏，此时紧密连接蛋白的细胞黏附功能和维持上皮细胞极性的功能受到影响。如前所述Occludin的作用主要是调节紧密连接蛋白的功能而不是参与TJ的生成，因此推测LPS持续作用一段时间后，Occludin的调节功能被充分激活17 ，需要调节其他紧密连接相关蛋白以适应LPS的刺激。在妊娠7 d、分娩后5d时，LPS对JAM表达量的影响不显著，但在妊娠14d时LPS可使JAM的表达量显著降低。由于JAM可与跨膜蛋白Claudin及Occludin共同构成紧密连接的跨膜结构，由此表明，LPS可通过降低JAM的表达来破坏紧密连接的跨膜结构，从而影响紧密连接的选择性通道屏障功能，但这个过程需要LPS持续作用于子宫一段时间 18-2 0 。妊娠14d，子宫通过增加黏蛋白的分泌量来增加黏液层的防御能力，此时具有调节作用的紧密连接蛋白Occludin的表达量上调，以充分调节紧密连接相关蛋白的功能以适应LPS的损伤，并维持上皮细胞的物理屏障。综上所述，当小鼠子宫内膜受到LPS的刺激之后，在妊娠7 d时，子宫内膜中黏蛋白的表达量有所降低。且LPS能引起紧密连接相关蛋白JAM及E-Cad-herin的表达量显著减少，并引起其他蛋白的变化。LPS对黏蛋白和紧密连接相关蛋白的作用可引起子宫内膜黏液屏障和物理屏障受到损害，从而增加子宫非特异性屏障的通透性。本实验首次研究LPS对子宫黏液层主要黏蛋白的影响，为LPS对子宫上皮细胞黏液层结构损伤的机理研究奠定了基础和参考依据。参考文献：1刘依铭，许冬梅，楼柏丹，等.脂多糖诱导黑龙江林蛙炎症损伤中抗氧化机制的研究 .中国预防兽医学报，2023,45(7):744-749.2】李慧，刘宇飞，李金龙，等.蒲公英和板蓝根对LPS诱导的小鼠肠黏膜屏障损伤的调理机制研究 J.中国预防兽医学报，2 0 2 3，45(8)：8 59-8 6 3.3 吴艳茹，陈巧玲，刘志勇，等.多杀性巴氏杆菌脂多糖刺激羊支气管上皮细胞后的转录组测序与分析 J.中国预防兽医学报，2 0 2 2，44(7)：7 0 4-7 11.4 DOMINGUEZ F,GALAN A,MARTIN J J L,et al.Hormonaland embryonic regulation of chemokine receptors CXCR1,CX-CR4,CCR5 and CCR2B in the human endometrium and the hu-man blastocyst JJ.Mol Hum Reprod,2003,9:189-198.5 邢波建，景一明，王权，等.LPS诱导下鹅TLR15及相关免疫因子的表达分析 J.中国预防兽医学报，2 0 2 0，42(7)701-705.6 KRAUSE G,WINKLER L,MUELLER S L,et al.Structure andfunction of claudins J.Biochim Biophys Acta Biomembr,2008,1778:631-645.7LAU S K,WEISS L M,CHU P G.Differential expression ofMUC1,MUC2,and MUC5AC in carcinomas of various sites:animmunohistochemical study J.Am J Clin Pathol,2004,122:61-69.8 MORRISON C,MERATI K,MARSH J R W L,et al.Themucin expression profile of endometrial carcinoma and correla-tion with clinical-pathologic parameters J.Appl Immunohis-tochem Mol Morphol,2007,15:426-431.9LEE K Y,DEMAYO F J.Animal models of implantation J.Reproduction,2004,128:679-695.10 LUO JIA,XU YAN-WEN,ZHANG MIN-FANG,et al.Mag-nolol inhibits LPS-induced inflammatory response in uterine ep-ithelial cells J.Inflammation,2013,36:997-1003.11 SAITOU M,FURUSE M,SASAKI H,et al.Complex pheno-type of mice lacking occludin,a component of tight junctionstrands J.Mol Biol Cell,2000,11:4131-4142.12 TAYLOR-PAPADIMITRIOU J,BURCHELL J M,GRAHAM R,et al.Latest developments in MUC1 immunotherapy J.Biochem Soc Trans,2018,46:659-668.13 WEI ZHENG-KAI,WANG JING-JING,SHI MING-YU,et al.Saikosaponin a inhibits LPS-induced inflammatory response byinducing liver X receptor alpha activation in primary mousemacrophages J.Oncotarget,2016,7:48995.14 NUSRAT A,BROWN G T,TOM J,et al.Multiple protein in-teractions involving proposed extracellular loop domains of thetight junction protein ocludin J.Mol Biol Cell,2005,16:1725-1734.15 PARIKH K,ANTANAVICIUTE A,FAWKNER-CORBETT D,et al.Colonic epithelial cell diversity in health and inflammatorybowel disease J.Nature,2019,567:49-55.16 RAO R.Occludin phosphorylation in regulation of epithelialtight junctions J.Ann N Y Acad Sci,2009,1165:62-68.第12 期李慧，等。脂多糖对妊娠周期小鼠子宫内膜上皮黏膜免疫屏障影响的研究130117 WU HAI-CHONG,JIANG KANG-FENG,YIN NAN-NAN,etal.Thymol mitigates lipopoly-saccharide-induced endometritis byregulating the TLR4-and ROS-mediated NF-kB signaling path-ways J.Oncotarget,2017,8(12):20042.18 YAN DU-JIAN,QIANG YU-YUN,TIAN TIAN,et al.The ef-fect of endotoxin on the intestinal mucus layer in non-andpost-pregnancy mice J.Front Vet Sci,2021,8:824170.19 ZHANG HUA,WU ZHI-MIN,YANG YA-PING,et al.Catalpolameliorates LPS-induced endometritis by inhibiting inflammationand TLR4/NF-kB signaling J.J Zhejiang Univ Sci B,2019,20:816-827.20 ZHANG MING-MING,AN LI-YAN,HU WEN-XIANG,et al.Mechanism of endometrial MUC2 in reproductive performancein mice through PI3K/AKT signaling pathway after lipopolysac-charide treatment J.Ecotoxicol Environ Saf,2022,231:113-177.(本文编辑：彭永刚；英文编辑：赵东明)