中国荷斯坦奶牛κ-酪蛋白可变剪切及蛋白突变类型的研究.pdf

中国牛业科学2 0 2 3，49（5）：2 9-37China Cattle Science科学试验中国荷斯坦奶牛K-酪蛋白可变剪切及蛋白突变类型的研究吴品慧，王潇阳，李文清（河南农业大学生命科学学院，河南郑州450 0 0 2）摘要：【目的】k-酪蛋白蛋白突变与奶牛生产性能和乳品加工性能关系密切,监控中国荷斯坦奶牛K-酪蛋白的蛋白突变，可以防止对生产不利的突变的发生。【方法】以50 头不同泌乳期的中国荷斯坦奶牛为研究对象，获取每头奶牛乳中的体细胞,提取RNA,反转录为cDNA,设计不同引物,分别扩增 k-酪蛋白可变剪切体序列和 CDS序列,并进行测序、蛋白突变分析、突变蛋白的磷酸化、糖基化分析。【结果】测序结果表明在不同泌乳期中国荷斯坦奶牛k-酪蛋白只存在Ensemble数据库中公布的57 3bp的剪切形式，不存在另一种剪切体。k-酪蛋白的CDS区存在三处碱基突变,即c.536TC、c.57 2 C A、C.6 33G A,形成的蛋白突变型只有A型和B型两种。A型与B型相比,A型多了两个磷酸化位点（136 位和142位和一个0 型糖基化位点(157 位）。【结论】不同泌乳期的中国荷斯坦奶牛k-酪蛋白只存在57 3 bp的剪切体,蛋白突变型只存在A型和B型,未检测到其它突变型,依据生产目的不同，可对A型奶牛与B型奶牛进行筛选。关键词：中国荷斯坦奶牛；K-酪蛋白；可变剪切；蛋白突变型；预测中图分类号：S823牛奶中8 0%的蛋白是由4个酪蛋白基因编码的,它们紧密连接在6 号染色体2 50 kb范围的酪蛋白基因簇上。按照顺序，它们分别是CSN1S1、CSN2、CSN 1S2 和 CSN3,分别编码 s1-酪蛋白、-酪蛋白、s2-酪蛋白和k-酪蛋白 。其中k-酪蛋白位于酪蛋白胶束的表面,是凝乳酶的天然底物,也是一种对Ca+不敏感的蛋白,并且是酪蛋白胶束形成不可缺少的成份 2 3目前检测到牛k-酪蛋白共有13种蛋白突变，分别是A、B、B2、C、D、E、F1、F2、G 1、G 2、H、I、J,及一个同义突变A145。k-酪蛋白蛋白突变与奶牛生产性能和乳品加工性能关系密切，在奶牛遗传育种上常作为分子遗传标记,以提高奶牛育种效率和经济效益。国外大型奶牛养殖企业不停地监控乳蛋白的突变,防止对生产不利的突变的发生。但是对于中国荷斯坦奶牛目前是否存在k-酪蛋白可变剪切体,及k-酪蛋白蛋白主要的突变形式尚不清楚。本试验以河南开封杞县农场的荷斯坦奶牛为试验对收稿日期：2 0 2 3-0 9-19 修回日期：2 0 2 3-10-2 4基金项目：2 0 2 2 年河南省科技攻关项目（2 2 2 10 2 110 0 51）作者简介：吴品慧（19 9 9 一），女，硕士，研究方向：奶牛营养与牛奶品质调控。*通讯作者：李文清（19 7 9 一），女，副教授，研究方向：奶牛营养与牛奶品质调控。文献标识码：A文章编号：10 0 1-9 111(2 0 2 3)0 5-0 0 2 9-0 9象,拟检测不同泌乳阶段的奶牛k-酪蛋白是否存在Ensemble公布的两种可变剪切体,及k-酪蛋白的主要蛋白突变形式。1材料和方法1.1样品采集采样地位于河南开封杞县农场。对50 头健康的荷斯坦奶牛采集奶样，每头奶牛采集15mL奶样，4保存于保温箱中，快速运至试验室。采用低温离心机,4C2000g离心10 min，去除上层的脂肪和中层清澈的奶成份，保留试管底部沉淀的体细胞。其中1管体细胞中加 1 mL TRIzol,转移至 1.5 mL无RNA酶的离心管中，保存于-8 0 冰箱,用于后续RNA的提取。50 头奶牛中，泌乳早期奶牛15头，泌乳中期奶牛30 头，泌乳晚期奶牛5头。1.2样品RNA的提取与反转录每个样品都单独提取RNA。操作步骤如下：将加了1mLTrizol的样品从-8 0 冰箱中取出,在室30温下放置5min，涡旋振荡15s，4下10 0 0 0 g离心5min。将上清移到新的1.5mL的离心管中,加0.2mL的氯仿,剧烈振荡15s，室温放置3min,410000g离心15min。将水相移入新的离心管中,加0.5mL的异丙醇,室温放置10 min,410 0 0 0 g 离心10 min，移去上清。加1mL75%乙醇洗涤RNA沉淀，4不超过7 50 0 g离心5min，弃上清。室温放置干燥5min，加入10 L无RNase的水溶解RNA,放人-8 0 冰箱中保存备用。反转录采用天根的反转录酶（ER107-02）,按照说明书进行操作，获得每个样品的cDNA。1.3CSN3基因两种可变剪切体的PCR扩增以Ensemble 数据库（https:/www.ensembl.org/index.html）中公布的牛k-酪蛋白2 种可变剪切体为基础（如图1所示），研究不同泌乳阶段的中国CSN3-201-ENSBTAT0000028685proteincodingCSN3-202-ENSBTAT00000072925protein coding注：实心框为编码区,大小分别为57 3bp和540 bp1.40.8%琼脂糖胶和8%PACE胶分离PCR产物预测可能产生的两个PCR产物大小相差33bp,因此采用0.8%琼脂糖胶和8%PACE胶分别进行分离。10 0 mL0.8%琼脂糖胶的配制方法为：称取0.8 g琼脂糖置于三角瓶中,加人10 0 mL1xTAE缓冲液,将该三角瓶放于微波炉中加热1min,加热结束后拿出来冷却2 min,加入0.5L TS-GelRed核酸凝胶染,充分混匀。10 mL8%PAGE胶的配制方法为：将所有试剂放于通风橱，在烧杯中依次加入2.5 mL 1.5 mol/L Tris-HCl,2.7 mL30%Acr-Bis,100L10%过硫酸铵,4.6 mL ddH,0,6L TEMED。1.5PCR产物与 T载体连接、测序按照琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根，货号：DP209-02)说明书,将PCR产物切胶回收。按照T载体连接试剂盒（天根，货号：VT3020 2）说明书，将PCR回收产物与T载体进行连接、转化感受态细胞、涂板、挑取单克隆进行测序。1.6PCR扩增 CSN3基因cDNA全长将10 个样品的cDNA进行混合，50 个样品共形成5个混合样。以混合样cDNA为模板，以 En-semble数据库中牛的CSN3基因（TranscriptID：中国牛业科学荷斯坦奶牛是否存在Kk-酪蛋白这2 种剪切形式。将Ensemble数据库公布的k-酪蛋白的2 种剪切体编码区的序列进行比对,发现它们编码区的起止位点相同，但2 种剪切体CDS长度不同，分别为540bp和57 3bp。因此,我们设计扩增CDS区全长的通用引物,CSN3-CDS-F:5=ATGATGAAGAGTTTTTTC-CT-3,CSN3-CDS-R:5*-TTAGACCGCAGTTGAAG-TAA-3。将50 头牛的cDNA各取0.5L进行混合，再将混合cDNA进行10 倍稀释,以此为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为50 L：CSN 3-CD S-R2L、CSN 3-CD S-F 2 L、混合 cDNA 2 L、2xEsTaqMasterMix（D y e）2 5 L、RN a s e-f r e e d d H,O19L。P CR反应条件为：预变性9 42 min;接着变性9 430 s，退火5530 s,延伸7 2 30 s，共30个循环；然后是延伸7 2 2 min。13.06kbForward strand10.59kbForward strand图1Ensemble数据库记录的牛k-酪蛋白的2 种剪切体ENSBTAT00000028685.5）作为参照序列设计引物，PCR扩增 CSN3的 mRNA全长。上游引物 CSN3-mRNA-F：5=CT T A CA G T G G A A A G G CCA A C-3，下游引物 CSN3-mRNA-R:5-TGCATTTGATTGGCTTTATT-3,目的片段大小为8 46 bp。P C R的体系为：cDNA2L,CSN3-mRNA-F 2 L,CSN3-mRNA-R 2 L,2xEsTaq MasterMix（D y e)2 5 L,ddH,O 19 L。P CR 的反应条件为：预变性9 42 min；变性9 430 s，退火50 30 s，延伸7 2 30 s，共30 个循环；延伸保持7 2 2 min。1.7CSN3基因 cDNA全长的测序将扩增的CSN3基因cDNA全长的产物送至上海生物工程有限公司进行双向测序,测序结果应用DNA star软件和Chromas软件进行分析。1.8CSN3基因蛋白突变类型分析将从 Ensemble 下载的 CSN3 基因 CDS 序列与样品测序得到的CDS序列应用DNAStar软件翻译为氨基酸序列,并应用在线比对软件NovoPro（多序列比对 在线工具 纽普生物 NovoPro)进行氨基酸序列比对,并根据 CSN3的蛋白命名表1,查阅蛋白类型。第49 卷第5期基因蛋白1269010129409312950971295197129711041306513513068136130961451310414813111150131191531312415513162167131651681.9CSN3主要蛋白突变型翻译后修饰的比较对中国荷斯坦奶牛k-酪蛋白主要蛋白突变型应用在线工具（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.phpNetPhos-3.1）进行磷酸化位点预测，输人FASTA格式的16 9 个氨基酸组成的成熟肽序列，将分数在0.5以上的磷酸化位点保留下来。对中国荷斯坦奶牛k-酪蛋白主要蛋白突变型应用软件进行糖基化位点预测。N 型糖基化位点预测网址:ht-tp:/www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/6),O 型糖基化位点预测网址：http：/w w w.c b s.d t u.d k/s e r v-ices/NetOGlyc/71.10中国荷斯坦奶牛K-酪蛋白两种乳蛋白突变型的3D结构预测应用在线软件I-TASSER(I-TASSER server forprotein structure and function prediction(zhanggroup.吴品慧，等：中国荷斯坦奶牛k-酪蛋白可变剪切及蛋白突变类型的研究表1 牛 k-酪蛋白14 种类型对应的基因和氨基酸突变位点 4AABB2CGCArgACTThrCGTArgCGTArgTCASerACCThrACCThrACTThrGATAspCCACCGProATTleAGCSerACTThrGCAAla31CSN3突变CDEFlCACHisACCThrCATCATHisHisATC ATC ATCIleIleACTThrACCGCGGCGGCGF2TGTCysATCIleACGGTTIleValGCCGlyorg)预测牛A型和B型k-酪蛋白的3D结构。预测原理：蛋白质的天然构象对应其能量最低的构象，因此通过构造合适的能量函数及优化方法，实现从蛋白质序列直接预测其三维结构的目的。2结 果2.1可能存在的两种剪切体的PCR扩增产物的分离结果琼脂糖凝胶的浓度为0.8%。M为DL2000的marker,1和2 为混合cDNA样品的PCR扩增的两个产物。由上述图2 和图3可知，不论琼脂糖胶还是PACE胶在50 0 bp上方均未跑出两条带，表明本试验选取的样本不存在Ensemble报道的两种可变剪切形式,即540 bp和57 3bp的剪切体。GlGCTAlaACCGCGG2ATCIleH1CCAAlaATCIleGCTAlaArgJ32中国牛业科学第49 卷345M2000bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图2 K-酪蛋白 CDS区PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图PACE胶的浓度为8%;M为DL2000的marker;1,2,3为同一混合cDNA样品的PCR扩增产物；4,5,6为同一混合cDNA样品的PCR扩增的产物。Poition:56680translateConsensusTTCGATTTTAGACCGCAGTTGAAGTAACTTGGACTGTGTTGATCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTTCTGGAGAAGCTTCTAGAGTAGCTACAGTGCTCTCTACTGCTTCGATGGTAGGTGTACDS_M13F_T5520220617-029-03193_G06.seq(11095)TTCGATTTTAGACCGCAGTTGAAGTAACTTGGRCDS-846.geq(1573)ITTAGACCCCAGTTGA1000bp750bp500bp250bp100bp图3k-酪蛋白CDS区PCR产物的PACE胶电泳图2.2PCR产物与T载体连接后的测序结果将上述切胶纯化的PCR产物与T载体连接测序,图4为单克隆的测序结果。从测序结果可以看出中国荷斯坦奶牛 CSN3 基因 CDS 区只存在一种剪切形式,即57 3 bp的剪切体。1.09507090100GO401500AAAACGAATCAGAG170LCAGTGCTCTCTACTGCTTCGATGGTAGGTGTAGATGGTAGGTGTA180Position:566TranslateConsensusCDS_M13F_TSS20220617-029-03193_G06.seq（1 10 9 5)CDS-846.9eq(1573)1.095m1801902002101220L230240L250TAGGTGTACTTGTAGGCTCACCACTAGCAATGGTATTGATGGTAGGGATTTCTGTTTTATCCTGATTTTTCTTTGGTGGAATGGCCATAAATGATAAATGTGGGTGTGGGTGACGTGCCATGTAGGTGTACTTGTAGGCTCACCACTAGCAATGGTATTGATGGTAGGGATTTCITTGGTGGAATGGCCATAAATGATAAATGTGGGTGTGGGTGACGTGCCATGTAGGTGTACTTGTAGGCTCACCACTAGCAATGGTATLGATGGAL290ACGIPAEGGIGGAATGATAAATGATAAATGTGGGTGTGGGTGACGTGCCATPosition:566TranslateConsensusCDS_M13F_TS520220617-029-03193_G06.seq(11095)CDS-846.seq(1573)1.095kbL300TGCCATGGTAGTTGGCTGGGCTTGGCAGGACTTGGCAGGCACAGTATTTGACAAAACTTGCCATTGAAGAATTTGGGCAGGTGACCTAACTGCAGCTGGCTTTGCATAATATGGGTATGGCAGTGCCATGGTAGTTGGCTGGGCTTGGCAGGACTTGGGCAGCTGGCTITGCATAATATGGGTATGGCAGTGCCATGGTAGTTGGCTGG330.ANLAALA340350元CACAGTAIITGACAAACTTGC360元AGAAIOIGGGAGGIGAE370380元LLALCATAATATGGGTATGGCAG390元400410Pos1tion:566TranslateConsensusCD5_M13E_TS520220617029-03193_G06.8e(11095)CDS-846.seq(1573)2.3CSN3基因cDNA全长的电泳结果与测序结果CSN3mRNA全长PCR扩增后,用1%浓度的琼脂糖进行凝胶电泳,结果如下图5所示。目的片段大小与预计的8 46 bp相符。由于PCR产物测序上下游起始各有50 bp碱基测不准确,本研究只选择 CSN3 基因 mRNA 的 CDS区全长(6 7 bp-639 bp)进行 SNP分析。分析结果如下图6 所示,CDS 区存在三处碱基突变,即c.536TC,c.572CA,c.633GA。红色框中是发生突变的碱基，上方的数字是该碱基在cDNA 中的位置,6 39 位碱基之后是该基因的3 UTR序列。Chromas 峰图中颜色嵌套的峰即为两种碱基都存在。1.095kb530元540GAAGAATCTTTCATCTTTCTCACAGCGTATTGGTTGTTCTTGGTTTTGCTCCTGGGCACCCAAAAATGGCAGGGTTAATGCCAGGATAGTCACAACTAGGAAAAAACTCTTCATCATAATCACGAAGAATCTTTCATCTTTCTCACAGCGTATTGGTTGTTCTTGGITTTGCTCCTGGGCACCCAAAAATGGCAGGGTTAATGCCAGGATAGTCACAACTAGGAAAAAACTCTTCATCATAATCACGAAGAATCTTTCATCTTTCTCACAGCGTATTGGTGITCTTGGTTTTGCTCO图4测序结果比对图2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM为DL2000的marker,1-5泳道分别为1-10,11-2 0,2 1-30,31-4041-50号样品混合cDNA扩增产物。8 46 bp的扩增条带与预期一致。图5CSN3基因DNA全长的PCR扩增550元560570580590M600261034620630AAACTCTTCATCAT!5846bp640第5期TranslateConsensus0002_3212205260133_(1-10)_846R)，n e q(1 8 18)0010_32122052601337_(41-50)_846R).seq(1818)0008_32122052601336_(31-40)_84eR）.s e q（1 0 2 2)0006_32122052601335_(21-30)_846R).8eq(1821)0004_32122052601334_(11-20)_84eR).seq(1823)ENSEMBLE-846-CDUA.Seq(1846)0005_32122052601335_(21-30)_846E).seq(1824)003_32122052601334_（11-2 0)_8 46 F）.56 q（1 8 2 4)）07_32122052601336_(31-40）_8 46 7）.8 6 q（1 8 2 3)0001_32122052601333_(1-10)_846F).eq(1823)0009_32122052601337_(41-50)_846F).seq(1821)吴品慧，等：中国荷斯坦奶牛k-酪蛋白可变剪切及蛋白突变类型的研究536CTACCATCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAGCTACTCTAGAAGMTTCTCCAGAAGTTATTGAGAGCCCACCTGAGATCAACACAGTCCAAGTTACTTCAACTGCRGTCTACTACCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAGCTACTCTAGAACTACCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAGCTACTCTAGNCTACCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAGCTACTCTAGAACTACCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAGCTACTCTAGACTACCGAAGCAGTAGCTACCGAAGCAGTACTACCAGAAGCAGTACTACCTGAAGCAGTACTACCGAAGCAGCTACCATA33572633TCTOCCACAGTCCAAGTIACTTCAACTGTCTCCACAAGTTACTTCAACTGTCTCCAGAUCCAAGTTACTTCAACTGCTTCAACTGACOCTCC641ATACTCEtCTAACTCCTCTAAACTCTdTCTAACTCGTCTAACTCTAACTTCTAAAAOTTCTARACTCTATCTAACTCTAUTCTAAACTCTTCTAACTCTAACTCACTCTACTCT536CC572AC633CGAAGCTC工工GCGGCT图 6 k-酪蛋白基因编码区测序结果及突变碱基对应的 Chromas 峰图2.4CSN3基因蛋白突变类型分析结果中国荷斯坦奶牛k-酪蛋白编码区的碱基和对应氨基酸的突变结果如表2 所示。Ensemble数据库的CSN3转录本（ENSBTAT00000028685.5）翻译的是B型k-酪蛋白。以此为参照,本次试验的中国荷斯坦奶牛部分个体k-酪蛋白成熟肽136 位由异蛋白突变染色体上的位置等位基因CSN3*A6:85656736CSN3*A6:85656772CSN3*A6:85656833注：c.代表着cDNA,后面的数字是该位点在cDNA全长中的位置;p.代表着蛋白,后面的数字是该氨基酸在成熟肽中的位置。2.5CSN3主要蛋白突变型翻译后修饰的预测结果磷酸化主要集中在丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基上，这些残基上具有游离的羟基，且本身不带电荷，当磷酸化后蛋白质便具有了电荷，从而使结构发生变化,进一步引起蛋白质活性的变化。A型与B型相比，多出两个磷酸化位点：136 位和142 位。其中136位是由于异亮氨酸突变为苏氨酸形成的磷酸化亮氨酸变为苏氨酸,148 位由丙氨酸变为天冬氨酸，且第10、9 7、10 4、135、155位氨基酸都与A型一致。由上述结果可知，中国荷斯坦奶牛k-酪蛋白主要有两种类型：A型和B型,这两种类型的乳蛋白突变在奶牛中是最常见的,没有检测到其它的蛋白突变型。表2 中国荷斯坦奶牛k-酪蛋白编码区的突变结果SNP号c.536T Crs43703015c.572C Ars43703016c.633G Ars110014544位点;142 位在两种蛋白类型中都是苏氨酸，A型蛋白此位点磷化的可能性大于0.5,而B型小于0.5，因此未显示出来。k-酪蛋白两种乳蛋白突变型的糖基化预测,N型糖基化位点预测是基于Asn-Xaa-Ser/Thr 的人工神经法,结果两种乳蛋白类型均未发现N型糖基化位点。0 型糖基化位点预测结果如下表3所示：ThreonineTyrosineThreshold密码子aTc/aCcgCVgAtgcG/gcA氨基酸变化p.136 Ile Thrp.148AlaAspp.168 AlaSerine结果错义突变错义突变同义突变2040图7k-酪蛋白A型预测的磷酸化位点60Sequenceposition8810012014016034中国牛业科学第49 卷SerineThreonineTyrosineThreshold20表3K-酪蛋白A型和B型预测的O型糖基化位点40图8 k-酪蛋白B型预测的磷酸化位点60Sequenoe position88100120140160A型与B型相比,多出一个O型糖基化位点：157位。此位点就是去掉信号肽序列后（信号肽为前2 1个氨基酸）,成熟肽的136 位，由异亮氨酸变为苏氨酸的位点。可见由于氨基酸的改变,此位点的糖基化状态也发生了改变。2.6k-酪蛋白两种乳蛋白突变型的3D结构预测结果依据能量最低原则预测的k-酪蛋白的天然3D结构,结果如图9 所示。k-酪蛋白A型和B型3D构型的差异可能引起乳品生产加工性能的改变。注：A指A型k-酪蛋白,B指B型k-酪蛋白图9 A型和B型k-酪蛋白的3D结构ble数据库中记录的是不同品种的奶牛出现在不同3 讨 论剪切形式,对于中国荷斯坦奶牛 CSN3 基因并不存可变剪接是指从一个mRNA前体中通过不同在540 bp的剪切形式。但是中国荷斯坦奶牛k-酪的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同蛋白是否存在其它的可变剪切形式还未可知，目前的mRNA剪接异构体的过程。可变剪切在真核生也未见文献报道。物体内广泛存在,有研究指出,对于人类基因组中包K-酪蛋白 SNP影响生产性能的报道各不相含多个exon的基因而言,其中有9 5%的基因都存在同 8-10 ,这并不意味着 SNP不影响生产性能。之前，可变剪切现象。可变剪切导致了转录本和蛋白质结研究学者将注意力集中于编码区的 SNP造成的错构与功能的多态性,是一种重要的转录调控机制。义突变,研究这些突变与乳脂含量、乳蛋白含量、产经典剪切位点突变：剪切是指发生DNA转录成奶量的关联性 8-10 。但是现在发现同义突变对蛋白RNA后,去掉内含子的过程。在剪切过程中，内含质的表达可能也有影响。本试验中，在成熟肽的子与外显子的连接区域碱基序列为外显子+GT+168位,虽然氨基酸没变化,发生的是同义突变,但内含子+AG时,GT.A G 某一位点发生突变时,会是依据最近的研究报告,在酿酒酵母中基因的同义造成剪切异常。本研究以Ensemble数据中公布的突变并不是中性的,可能会降低 mRNA 的浓度,对牛k-酪蛋白2 种可变剪切体为基础,研究不同泌乳生物有很大的害处 。在乳蛋白中是否具有同样阶段的中国荷斯坦奶牛是否存在k-酪蛋白这2 种的作用，还未进行验证，但是同义突变现在应当引起剪切形式,以及不同的剪切体是否是由 SNP引起重视。另外,非编码区与编码区的互作也会造成蛋的。但是本试验并没有检测出两种可变剪切体，只白表达的改变。将来动物育种方面的基因筛选不仅存在57 3bp长度的剪切体。这可能是因为Ensem-仅考虑单一的SNP信息，还应考虑编码区与非编码第5期吴品慧，等：中国荷斯坦奶牛k-酪蛋白可变剪切及蛋白突变类型的研究#seqnamesourcefeature startAnet0G1yc-4.0.0.13AnetoGlyc-4.0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13AnetoGlyc-4.0.0.13Anet0G1yc-4.0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13AnetoGlyc-4.0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13AnetoGlyc-4,0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13AnetoGlyc-4.0.0.13AnetoGlyc-4.0.0.13AnetoGlyc-4.0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13AnetoGlyc-4.0.0.13AnetoGlyc-4.0.0.13AnetoGlyc-4.0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13Anet0Glyc-4,0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13AnetoGlyc-4.0.0.13Anet0Glyc-4.0.0.13Anet0G1yc-4.0.0.13AnetoGlyc-4.0.0.1335endscorestrandframecommentCARBOHYD4CARBOHYD10CARBOHYD15CARBOHYD40CARBOHYD54CARBOHYD58CARBOHYD90CARBOHYD101CARBOHYD103CARBOHYD108CARBOHYD114CARBOHYD115CARBOHYD125CARBOHYD138CARBOHYD142CARBOHYD145CARBOHYD148CARBOHYD152CARBOHYD153CARBOHYD154CARBOHYD156CARBOHYD157CARBOHYD162CARBOHYD163CARBOHYD166CARBOHYD170CARBOHYD176CARBOHYD182CARBOHYD186CARBOHYD187CARBOHYD18841015405458901011031081141151251381421451481521531541561571621631661701761821861871880.006585320.03590620.1241140.08369990.08247320.2277110.1208990.5442590.4266890.8317710.5189630.6034360.2990540.4595790.7047110.6141640.8979860.7949290.7982020.8379550.7921960.6641750.8739090.7968080.5851950.2531550.2313070.1363030.1213210.2067980.0895053#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVEBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBnet0G1yc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13netoGlyc-4.0.0.13netoGlyc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13netoGlyc-4,0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0G1yc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13netoGlyc-4.0.0.13netoGlyc-4,0.0.13net0G1yc-4.0.0.13net0G1yc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0G1yc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13net0Glyc-4.0.0.13netoGlyc-4.0.0.13CARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYDCARBOHYD410154054589010110310811411512513814214514815215315415616216316617017618218618718841015405458901011031081141151251381421451481521531541561621631661701761821861871880.006615570.03728210.1280590.08990740.08910220.2336880.1243550.5508070.4342550.8366170.5261380.6094530.3084360.4589280.7104240.6260210.8604530.7350350.70301.0.7304910.5766420.8466940.7047990.5647540.4234960.2518580.1309750.1180710.2011610.0869223#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVE#POSITIVEAB区的相互作用,例如5或3 侧翼区的SNP对基因表达调控的影响,这种互作可以强烈地影响整体的基因表达 12 Ok-酪蛋白蛋白突变影响乳品加工性能 13。本试验检测出的A型和B型突变是最常见的两种，它们的区别在于氨基酸第136 位和148 位的不同。A型第136 位和148 位的氨酸酸分别对应苏氨酸（T h r）和天冬氨酸（Asp），而B型分别对应为异亮36氨酸（Ile）和丙氨酸（Ala）【14。与k-酪蛋白A型相比,B型与凝乳酶的反应更迅速,凝乳时间更短，并且与有利的乳品加工指标相关,如热抵抗、凝固物的坚固度、芝士生产效率等 15-7 。这可能与B型蛋白比A型少了两个预测的磷酸化位点及一个O型糖基化位点有关。稀少的等位基因突变,如G型和E型对乳的凝固有负面影响 18 。许多学者推测这些突变可能影响k-酪蛋白的结构和糖基化模式 19 2 1。除了A 型和B型外,本试验并未检测出k-酪蛋白的其它蛋白突变。另外,依据生产目的的不同,也可以对 A 型和B型进行筛选 2 2 。4结论本研究以Ensemble数据库公布的k-酪蛋白的两种剪切形式(57 3bp和540 bp）为基础,检测不同泌乳期中国荷斯坦奶牛k-酪蛋白的剪切体形式，发现其只存在57 3 bp的剪切体。又对k-酪蛋白的蛋白突变型进行研究,k-酪蛋白的 CDS 区存在三处碱基突变,形成的蛋白突变型只有A型和B型两种,A型比B型多了两个磷酸化位点和一个O型糖基化位点,预测的这两种蛋白突变型的3D立体结构也不相同。在生产中要时时监控乳蛋白突变，防止有害突变的发生。参考文献：1李文清，王阳，李晨婉，等。通过测序与预测分析靶向奶牛乳腺k-酪蛋白的miRNAJ动物营养学报，2 0 2 1,33（12）：7131-7139.2FAN X,ZHANG Z,QIU L,et al.Polymorphisms of the kappacasein(CSN3)gene and inference of its variants in water buffalo(Bubalus bubalis)J.Archives animal breeding,2019,62(2):585-596.3MADENDE M,OSTHOFF G.Comparative genomics of caseingenes J.The Journal of dairy 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