造血干细胞分离培养方法.doc

(完整word)造血干细胞分离培养方法

一 造血干细胞分离
（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备
1 HES（羟乙基淀粉）沉淀法
抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。
2 percoll液密度梯度离心法
①按体积比为（1。5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液.4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1％白蛋白盐水液洗涤3次。
②取鼠股骨和胫骨 ， 在两头关节处切开骨骼 ， 反复用培养基冲洗骨髓腔 ， 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上 , 2 000 r / min 离心 20 min.吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。
3 Ficoll分离法
方法一 在15ml分离管中加7。5ml比重为1。017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min，吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。
方法二 取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1：1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上,注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，(后续在冰上进行)用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS,1500rpm×10分钟，L-DMEM洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。
取骨髓细胞悬液的方法是:取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min,之后在两头关节处切开骨骼 , 反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。
（二）Linc—- kit+造血干细胞的分离纯化.
去除 Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞 ； 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞 ， 包括 T ， B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞 ; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选）:带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞 , 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册）。
(三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化
流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液 ， 加入2.5μL CD45— FITC和10μL CD34- PE充分混合 ， 避光孵育15 min.以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定 ， 上机检测。
磁性标记 CD34+细胞：在细胞悬液中加入100μL Fc — R阻滞剂 , 再加入100μLCD34 磁珠标记细胞 ， 于4℃冰箱中充分混合孵育 30 min。用PBS 缓冲液洗涤细胞，离心10 min , 去上清液后再以500μL PBS缓冲液重新悬浮细胞。
MiniMACS磁性分离、纯化CD34+细胞：将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500μL PBS缓冲液漂洗。以孔径30μm的尼龙网或过滤器去除细胞悬液凝块 ， 细胞通过分离柱 ， 以500μL PBS 缓冲液冲洗 3次。 将分离柱从分离器中移出并放置在合适的试管中 , 于分离柱顶端滴注P BS 缓冲液 1 m L, 用分离柱配备的活塞加压将保留的细胞冲出。重复磁性分离步骤，将洗脱的细胞移至一个新的漂洗过的MS分离柱洗涤,用500μL PBS 缓冲液洗脱保留的细胞.
二 造血干细胞培养
1 粒—巨噬细胞集落生成单位（GFU-GM）培养（CD34+细胞的培养）
采用甲基纤维半固体培养基体系进行集落培养.培养体系中含有50μg / L重组干细胞生长因子( rhSCF）、10μg / Lrh GM-CSF、10μg / L重组白细胞介素( rhIL) -3。在1 mL培养体系中加入1×105个有细胞。5 %CO2 ， 37℃条件下培养14 d ， 倒置显微镜下计数CFU—GM集落数。
2 MNCs与HSCs的体外培养
（1） MNCs体外培养:用含10 %小牛血清的高糖DMEM培养基培养 ， MNCs以5×104个/ mL接种于24孔板中，每孔1 mL；（2）HSCs体外培养:用无血清高糖DMEM培养基，HSCs以1×104个/ mL 接种于24孔板中。细胞均置37℃,5％CO2饱和湿度培养箱中培养。
3 由MNC制备基质细胞层
取新鲜分离的单个核细胞1×106培养于1ml含10%胎牛血清的IMDM中,置于24孔培
养板中,于5％CO2，37℃饱和湿度的CO2孵育箱中，每7天半量换液1次，3周后培养孔底
铺满了基质细胞，去除悬浮细胞,用PBS洗2遍后，用含有EDTA的胰蛋白酶消化，1500RD
照射后将1x104/ml基质细胞移种于24孔板中,每孔1ml,继续培养2天备用.
4 由CD34+细胞制备基质细胞层
取新鲜分离的脐血CD34+细胞1x105培养于1ml无血清培养液(SCGM）中,加入细胞因子
FL+TPo+GM—IL—1+IL—6,细胞因子浓度为FL50ng/ml，TPO50ng/ml，GM一CSF、IL—1
和IL—6分别为10ng/ml，置于24孔培养板中，于5％CO2，37℃饱和湿度的CO2孵育箱中,
每7天半量换液1次,3周后培养孔底铺满了基质细胞,去除悬浮细胞，用PBS洗2遍后,
用含有EDTA的胰蛋白酶消化,1500拉德照射后将1xl了/ml基质细胞移种于24孔板中，
每孔1ml,继续培养2天备用。