造血干细胞分离培养方法.doc
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1、(完整word)造血干细胞分离培养方法一 造血干细胞分离(一)小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按41比例加入HES,自然沉降红细胞后,分离上清。4400 g离心10 min得细胞沉淀物,以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 按体积比为(1。52)1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液.4,1 5 00 r / min,离心20 min。取单个核细胞层,以1白蛋白盐水液洗涤3次。 取鼠股骨和胫骨 , 在两头关节处切开骨骼 , 反复用培养基冲洗骨髓腔 , 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上 , 2 000
2、 r / min 离心 20 min.吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法方法一 在15ml分离管中加7。5ml比重为1。017的Ficoll液,缓慢移入等量骨髓细胞悬液,整体平衡后低温离心2000r/min20min,吸取白细胞层,用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。方法二 取无菌离心管1支,预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1),用滴管取单细胞悬液3ml,沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上,注意保持清楚的界面,室温下水平离心2000rpm20分钟,(
3、后续在冰上进行)用毛细吸管插到云雾层,小心吸取单个核细胞,置入另一短中管中,加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS,1500rpm10分钟,L-DMEM洗涤细胞两次,每次以1000r/min离心10min,去上清液。(除第一步的室温离心外,其余为低温离心)。取骨髓细胞悬液的方法是:取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除,并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min,之后在两头关节处切开骨骼 , 反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔,从而得到骨髓细胞悬液。(二)Linc- kit+造血干细胞的分离纯化.去除 Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞 ; 抗生物素的磁珠吸附
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