ADDP细胞凋亡及其机制的研究应用.doc

A549/DDP细胞凋亡及其机制研究
1材料
1.1重要仪器
荧光显微镜及照相系统：Olympus公司
垂直电泳槽：Bio-Rad公司
电转移槽：Bio-Rad公司
恒温摇床：江苏太仓仪器公司
分光光度仪：Bio-Rad公司
遥控酶标仪：TECAN公司
台式高速离心机：eppendorf公司
别的同前两某些
1.2普通耗材
50mL/250mL细胞培养瓶：Nunc公司
6孔细胞培养板：Costar公司
60mm细胞培养皿：Costar公司
细胞刮刀：Nunc公司
1.3重要试剂
Hoechst33258染色试剂盒：碧云天公司
PI和Annexin V-FITC：美国BD公司
TUNEL试剂盒：罗氏公司
鼠抗人Caspase-8 p10单抗：Cell Signaling
HRP标记羊抗鼠二抗：武汉博士德公司
BCA法蛋白定量试剂盒：Pierce公司
ECL发光检测试剂盒：Pierce公司
硝酸纤维素转移膜(0.22μm)Amersham公司
DAB北京中杉公司
别的试剂同前两某些
1.4惯用缓冲液及培养基
结合缓冲液(×10)：
100 mmol/L HEPES(PH 7.5)
1.4 moL NaCl
25 mmol/L CaCl2
单去圬剂裂解液：
50 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0)
150 mmol/L NaCl
1%TritonX-100
100 g/mL PMSF
5×SDS蛋白上样缓冲液：
250 mmol/L Tris-HCl(PH 6.8)
10%SDS
50%甘油
0.5%溴酚蓝
500 mmol/L DTT(临用前现加)
电泳缓冲液：
25 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4)
250 mmol/L甘氨酸(PH 8.3)
0.1%SDS
转移缓冲液：
5.6 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4)
120 mmol/L甘氨酸
0.1%SDS
20%甲醇(V/V)
储存于4℃备用
PBS缓冲液
137 mmol/L NaCl
2.7 mmol/L KCl
10.0 mmol/L Na2HPO4
2.0 mmol/L KH2PO4
调节至PH=7.4
洗涤缓冲液(PBS-Tween-20)：
1000 mL PBS(PH7.4,0.01M)
500μL Tween-20
封闭缓冲液：
5 g脱脂奶粉
100 mL PBST
1.5细胞系
同第一某些
2办法
2.1 A549/DDP细胞凋亡检测
2.1.1细胞凋亡形态学观测
将A549/DDP细胞分别加入到含盖玻片6孔细胞培养板中，每孔细胞数为1×104个，培养过夜后，去培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L培养液继续培养24 h后终结培养，取出细胞爬片，按照Hoechst33258染色试剂盒阐明书进行染色。
①在细胞爬片上，轻轻滴加约500μL固定液，以刚覆盖爬片为宜，固定10分钟。
②去固定液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动多次。
③加入0.5mLHoechst33258染色液，染色5分钟，用手晃动多次。
④去染色液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动多次。
⑤滴加一滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞盖玻片，让细胞接触封片剂，避免气泡。
⑥上荧光显微镜观测，激发波长350nm，发射波长460nm。
2.1.2原位末端标记(TUNEL)染色
同上办法制备细胞爬片，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定后，按照TUNEL
试剂盒阐明书操作。
①在细胞爬片上，轻轻滴加约500μL固定液，以刚覆盖爬片为宜，固定30分钟。
②PBS洗片两次，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动多次。滴加内源性过氧化物酶阻断剂(0.3%H2O2-甲醇溶液)，室温孵育30分钟。
③同上用PBS洗片，滴加通透液(0.1%TritonX-100溶于0.1%枸橼酸钠溶液中)，在冰浴中孵育2分钟。
④PBS洗两次，滴加50μLTUNEL反映混合液，湿盒中室温孵育60分钟。
⑤PBS洗两次，滴加50μL转化剂-POD，湿盒中37℃孵育30分钟。
⑥PBS洗两次，加入DAB底物溶液，室温孵育10分钟。
⑦PBS洗两次，封片。光镜下观测。
⑧成果鉴定：细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性。每张片至少观测500个细胞，计算每100个细胞内阳性细胞，即凋亡指数(apoptotic index,AI)。
2.1.3流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡
①取对数生长期A549/DDP细胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬液。
②接种于直径60mm培养皿中，每孔4mL，细胞培养箱中过夜培养。
③次日吸弃原细胞培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L培养液，继续培养24h。
④常规消化，4℃离心(800rpm,5min)，收获各组细胞，转移至1.5mL离心管。
⑤弃上清，加入预冷1×结合缓冲液100μL，重悬细胞，置于冰浴。
⑥加入5μL Annex in V-FITC和5μL PI于细胞悬液中，混匀，4℃避光染色10min。
⑦补加490μL结合缓冲液混悬细胞，及时行FCM分析。
2.2姜黄素对A549/DDP细胞caspase-8影响
取对数生长期A549/DDP细胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬液，接种于直径60mm培养皿中，每孔4mL，细胞培养箱中过夜培养。次日吸弃原细胞培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L培养液，继续培养24h。
2.2.1样品制备
①提取细胞总蛋白：
a.培养液中悬浮细胞蛋白提取：各浓度姜黄素解决细胞24h后，终结培养。将培养皿中培养液转移至15mL塑料离心管中，4℃，2500rpm离心10min，弃上清，4℃1×PBS洗涤两次，加入单去污剂裂解液100μL于冰上裂解30min，将上清转移至1.5mL塑料离心管，备用；
b.贴于培养皿上细胞蛋白提取：4℃1×PBS洗涤培养皿两遍，加入单去污剂裂解液300μL于冰上裂解30min。裂解完毕后，用细胞刮片将细胞刮于一侧，转移至1.5mL塑料离心管中，4℃，1rpm离心10min。
c.将离心后上清液与从a中得到裂解上清混合，4℃，1rpm离心5min，取上清分装于0.5mL离心管中，置于－20℃备用。
②BCA法蛋白定量。
③取总蛋白含量相等上清体积，加入1/5体积5×SDS上样缓冲液，沸水煮5min，1rpm离心10min，备用。
2.2.2电泳
采用微型垂直蛋白电泳系统进行SDS-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，缓冲系统为Tris-甘氨酸电泳缓冲液。先后配制10%分离胶及4%浓缩胶，凝固后用微量加样器向加样槽中加入样品和次高分子量蛋白质原则，电泳装置与电源相连，凝胶上所加电压120V，当染料前沿进入分离胶后，把电压提至160V，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源。
2.2.3转移
将电泳后SDS-PAGE胶板置于转移缓冲液中平衡15min，再在转移缓冲液中进行电转移；将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，恒压60V，冷却系统中转移2h。转移完毕后将膜在丽春红染液中染色，观测电转成果。剪下目蛋白某些，做好标记，放入双蒸水中漂染，褪去染液颜色。
2.2.4 Western blot
①封闭：将膜置于平皿中，加入封闭液于室温缓慢摇动1h。
②与一抗孵育：将鼠抗人Caspase-8 p10单抗及β-actin作为一抗用PBS稀释(1:1000)，与膜共同封入塑料袋中，4℃过夜。
③洗膜：将膜从塑料袋中取出，PBST振摇漂洗3次，每次10min。
④与二抗孵育：将HRP标记羊抗鼠抗体作为二抗用PBST稀释(1:3000)，与膜共同封入塑料袋中，室温缓慢摇动1h。
⑤洗膜：同③。
⑥化学发光：将膜上液体用滤纸吸干，置于化学发光底物反映系统中反映5min，暗室X-光片1~5min。显影20sec，定影10min.
⑦扫描后，用LeicaQwin图象分析软件进行吸光度积分值分析。
2.3记录学解决
用SPSS11.0记录软件包解决，记录学办法采用单因素方差分析，SNK-q检查，x2检查，P＜0.05以为有记录学意义。
3成果
3.1 A549/DDP细胞凋亡检测
3.1.1细胞形态学变化
荧光显微镜下观测，姜黄素组某些细胞细胞核均有破裂，呈大、小不等，被荧光染料着色成致密浓缩发白发亮细胞核，此为典型细胞凋亡形态。其中以40μmol/L姜黄素组最多，对照组只见很少凋亡形态细胞(附图1)。
3.1.2 TUNEL检测细胞凋亡指数
原位DNA缺口末端标记染色，凋亡细胞核呈棕黄色，易于辨认(附图2)。
0，5、l0、20、30、40μmol/L姜黄素作用于A549/DDP细胞24 h后，凋亡指数分别是(2.6±0.5)%、(10.7±2.3)%、(20.5±3.1)%、(28.6±3.4)%、(35.7±0.4)%、(49.5±4.4)%，显示出明显剂量依赖关系(P＜0.05)。
3.1.3流式细胞仪检测细胞凋亡率
不同浓度姜黄素作用于A549/DDP细胞24 h后，经Annexin-V和PI进行染色后，用流式细胞仪分析凋亡细胞。流式细胞仪分析，获得由四个象限构成细胞直方图(图5)。第1象限代表细胞收集过程中浮现损伤细胞(An-PI+)，第2象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞(An+PI+)，第3象限代表正常细胞(An-PI-)，第4象限代表初期凋亡细胞(An+PI-)。本实验重要观测初期凋亡细胞，初期凋亡细胞即An+PI-细胞所占比例分别为2.93%、3.68%、7.71%、20.23%、23.0%、32.15%，显示出明显剂量依赖关系(P＜0.05)。
3.2 Western blot成果
不同浓度姜黄素解决A549/DDP细胞24h后，浮现Caspase8活性裂解片段P10蛋白条带(附图3)，且条带光密度积分值随姜黄素浓度而增强(图6)。
4讨论
细胞凋亡是细胞生物体一种重要自稳机制，是由体内外因素触发细胞内预存死亡程序而导致细胞死亡过程。研究表白，肿瘤发生很也许就是由于细胞增殖和凋亡失衡，导致肿瘤细胞无限无序增殖所致。诱导肿瘤细胞凋亡是许多抗癌成分十分重要抗癌机制之一。肿瘤化疗过程中，凋亡细胞不久被体内巨噬细胞清除，对周边炎症反映很少。因而通过诱导凋亡而杀死肿瘤细胞具备更少毒副反映，当前通过诱导或增进肿瘤细胞凋亡正成为肿瘤防治新思路，也是评估抗癌药物作用能力重要指标。细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst染色细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。本某些实验中，通过不同浓度姜黄素干预24 h后各组细胞，用Hoechst33258荧光染料染色后，在荧光显微镜下观测，姜黄素干预组均能找到较多胞核致密浓缩发白发亮细胞，并随着姜黄素浓度增长而增多，而对照组只见很少呈凋亡形态细胞，这表白姜黄素可诱导A549/DDP细胞凋亡。
细胞凋亡时DNA断裂会产生大量游离3’-羟基末端，运用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，无需DNA模板即可将生物素或地高辛标记外源性dUTP直接连接到凋亡细胞核DNA断链3’-羟基末端，通过过氧化物酶标记链卵白素或抗地高辛抗体与之结合，经DAB显色，检测细胞细胞与否存在外源性核苷酸掺入DNA片段，显示凋亡细胞。运用该技术能较精确地探测到细胞凋亡现象。本某些实验中，TUNEL成果示5μmol/L姜黄素作用24h即有被标记染色阳性细胞浮现，凋亡指数为(2.6±0.5)%，与对照组相比有明显性差别。随着剂量增大，凋亡指数增多，凋亡细胞占总细胞数比例升高。并且阳性细胞数随药物浓度递增。
流式细胞仪检测凋亡办法有各种，其中磷脂结合蛋白AnnexinV-FITC/PI双标记染色最为惯用。正常活细胞带负电磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)定位于细胞膜内侧。细胞凋亡初期，由于细胞膜失去对称性，PS从胞膜内侧暴露于胞膜外，成为巨噬细胞清除凋亡细胞辨认标志。AnnexinV-FITC是一种标记有荧光素钙依赖磷脂结合蛋白，与PS有很强亲和力，可特异地与PS结合。凋亡初期细胞仍保持膜完整性，PI不能进入细胞内，而凋亡晚期和发生继发坏死细胞可同步被AnnexinV-FITC/PI着色，运用流式细胞仪进行双参数分析，即可将凋亡细胞(AnnexinV+细胞)与继发坏死细胞(AnnexinV+/PI+细胞)区别开，并能计算出阳性细胞百分率。本某些实验中，FCM分析显示姜黄素作用于A549/DDP细胞24 h后，实验组细胞初期凋亡率即明显高于阴性对照组，且呈剂量依赖性，这进一步证明姜黄素可以诱导A549/DDP细胞凋亡。综上，本文从细胞形态，TUNEL检测，流式细胞仪分析等三个不同层面证明了姜黄素可以诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡，并呈剂量依赖性，该凋亡发生应当是姜黄素抗A549/DDP细胞增殖重要途径。
当前以为细胞凋亡通路重要有：细胞外(死亡受体)途径、细胞内(线粒体)途径和内质网途径，而天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl
aspartate-specific protease,caspase）活化是不同细胞凋亡途径中共同下游事件，活化后caspase通过切断与周边细胞联系、重组细胞骨架、制止DNA复制和修复、破坏DNA和核构造、诱导凋亡小体形成等调控着细胞凋亡过程。其中caspase-8在细胞凋亡中起着极其重要作用。caspase-8在caspase级联反映中属于启动性caspases，caspase-8活化是caspase级联反映第一步。caspase-8除了能启动细胞外途径以外，还能启动细胞内途径，因而caspase-8也是联系内外源凋亡途径桥梁。Karmakar等研究发现，姜黄素可通过死亡受体介导途径和线粒体介导途径诱导人恶性胶质瘤T98G细胞凋亡，涉及caspase8活化。caspase8在正常状态下是以酶原(procaspase8)形式存在，凋亡信号刺激下，被剪切激活释放出活性片段p18和p10，接着形成有两个大亚基和两个小亚基构成四聚体，即caspase-8，并从死亡信号复合体(DISC)中释放进入胞浆，继而再活化胞浆中下游caspase，形成caspase级联反映，将凋亡信号传至凋亡底物，最后发生凋亡。本研究中western-blot成果显示在姜黄素解决组，均可见caspase-8 p10条带，并随浓度增长条带光密度积分值逐渐升高。阐明姜黄素诱导A549/DDP细胞凋亡过程中存在caspase8活化，但与否存在不依赖caspase凋亡途径还不得而知。有研究表白，A549/DDP细胞之因此耐药，与细胞过度表达bcl-2而下调了caspase-8和细胞色素C蛋白表达关于。因而姜黄素与否是通过抑制A549/DDP细胞bcl-2过度表达，而上调procaspase-8和细胞色素C蛋白表达，再去激活caspase-8诱导凋亡，还需进一步探讨。