ADDP细胞凋亡及其机制的研究应用.doc
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1、A549/DDP细胞凋亡及其机制研究1材料1.1重要仪器荧光显微镜及照相系统:Olympus公司垂直电泳槽:Bio-Rad公司电转移槽:Bio-Rad公司恒温摇床:江苏太仓仪器公司分光光度仪:Bio-Rad公司遥控酶标仪:TECAN公司台式高速离心机:eppendorf公司别的同前两某些1.2普通耗材50mL/250mL细胞培养瓶:Nunc公司6孔细胞培养板:Costar公司60mm细胞培养皿:Costar公司细胞刮刀:Nunc公司1.3重要试剂Hoechst33258染色试剂盒:碧云天公司PI和Annexin V-FITC:美国BD公司TUNEL试剂盒:罗氏公司鼠抗人Caspase-8 p1
2、0单抗:Cell SignalingHRP标记羊抗鼠二抗:武汉博士德公司BCA法蛋白定量试剂盒:Pierce公司ECL发光检测试剂盒:Pierce公司硝酸纤维素转移膜(0.22m)Amersham公司DAB北京中杉公司别的试剂同前两某些1.4惯用缓冲液及培养基结合缓冲液(10):100 mmol/L HEPES(PH 7.5)1.4 moL NaCl25 mmol/L CaCl2单去圬剂裂解液:50 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0)150 mmol/L NaCl1%TritonX-100100 g/mL PMSF5SDS蛋白上样缓冲液:250 mmol/L Tris-HCl(PH
3、 6.8)10%SDS50%甘油0.5%溴酚蓝500 mmol/L DTT(临用前现加)电泳缓冲液:25 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4)250 mmol/L甘氨酸(PH 8.3)0.1%SDS转移缓冲液:5.6 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4)120 mmol/L甘氨酸0.1%SDS20%甲醇(V/V)储存于4备用PBS缓冲液137 mmol/L NaCl2.7 mmol/L KCl10.0 mmol/L Na2HPO42.0 mmol/L KH2PO4调节至PH=7.4洗涤缓冲液(PBS-Tween-20):1000 mL PBS(PH7.4,0.01M)500
4、L Tween-20封闭缓冲液:5 g脱脂奶粉100 mL PBST1.5细胞系同第一某些2办法2.1 A549/DDP细胞凋亡检测2.1.1细胞凋亡形态学观测将A549/DDP细胞分别加入到含盖玻片6孔细胞培养板中,每孔细胞数为1104个,培养过夜后,去培养液,加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40mol/L培养液继续培养24 h后终结培养,取出细胞爬片,按照Hoechst33258染色试剂盒阐明书进行染色。在细胞爬片上,轻轻滴加约500L固定液,以刚覆盖爬片为宜,固定10分钟。去固定液,用PBS洗两遍,每次3分钟,吸尽液体,洗涤时用手晃动多次。加入0.5mLHoechst332
5、58染色液,染色5分钟,用手晃动多次。去染色液,用PBS洗两遍,每次3分钟,吸尽液体,洗涤时用手晃动多次。滴加一滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上,盖上贴有细胞盖玻片,让细胞接触封片剂,避免气泡。上荧光显微镜观测,激发波长350nm,发射波长460nm。2.1.2原位末端标记(TUNEL)染色同上办法制备细胞爬片,PBS洗涤,4%多聚甲醛固定后,按照TUNEL试剂盒阐明书操作。在细胞爬片上,轻轻滴加约500L固定液,以刚覆盖爬片为宜,固定30分钟。PBS洗片两次,每次3分钟,吸尽液体,洗涤时用手晃动多次。滴加内源性过氧化物酶阻断剂(0.3%H2O2-甲醇溶液),室温孵育30分钟。同上用PBS洗片,滴
6、加通透液(0.1%TritonX-100溶于0.1%枸橼酸钠溶液中),在冰浴中孵育2分钟。PBS洗两次,滴加50LTUNEL反映混合液,湿盒中室温孵育60分钟。PBS洗两次,滴加50L转化剂-POD,湿盒中37孵育30分钟。PBS洗两次,加入DAB底物溶液,室温孵育10分钟。PBS洗两次,封片。光镜下观测。成果鉴定:细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性。每张片至少观测500个细胞,计算每100个细胞内阳性细胞,即凋亡指数(apoptotic index,AI)。2.1.3流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡取对数生长期A549/DDP细胞,常规消化,制备成105/mL细胞悬液。接种于直径60mm培养皿中,
7、每孔4mL,细胞培养箱中过夜培养。次日吸弃原细胞培养液,加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40mol/L培养液,继续培养24h。常规消化,4离心(800rpm,5min),收获各组细胞,转移至1.5mL离心管。弃上清,加入预冷1结合缓冲液100L,重悬细胞,置于冰浴。加入5L Annex in V-FITC和5L PI于细胞悬液中,混匀,4避光染色10min。补加490L结合缓冲液混悬细胞,及时行FCM分析。2.2姜黄素对A549/DDP细胞caspase-8影响取对数生长期A549/DDP细胞,常规消化,制备成105/mL细胞悬液,接种于直径60mm培养皿中,每孔4mL,细胞培养
8、箱中过夜培养。次日吸弃原细胞培养液,加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40mol/L培养液,继续培养24h。2.2.1样品制备提取细胞总蛋白:a.培养液中悬浮细胞蛋白提取:各浓度姜黄素解决细胞24h后,终结培养。将培养皿中培养液转移至15mL塑料离心管中,4,2500rpm离心10min,弃上清,41PBS洗涤两次,加入单去污剂裂解液100L于冰上裂解30min,将上清转移至1.5mL塑料离心管,备用;b.贴于培养皿上细胞蛋白提取:41PBS洗涤培养皿两遍,加入单去污剂裂解液300L于冰上裂解30min。裂解完毕后,用细胞刮片将细胞刮于一侧,转移至1.5mL塑料离心管中,4,1rp
9、m离心10min。c.将离心后上清液与从a中得到裂解上清混合,4,1rpm离心5min,取上清分装于0.5mL离心管中,置于20备用。BCA法蛋白定量。取总蛋白含量相等上清体积,加入1/5体积5SDS上样缓冲液,沸水煮5min,1rpm离心10min,备用。2.2.2电泳采用微型垂直蛋白电泳系统进行SDS-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,缓冲系统为Tris-甘氨酸电泳缓冲液。先后配制10%分离胶及4%浓缩胶,凝固后用微量加样器向加样槽中加入样品和次高分子量蛋白质原则,电泳装置与电源相连,凝胶上所加电压120V,当染料前沿进入分离胶后,把电压提至160V,继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部,关闭电源。2.2
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