CB518900-病毒与细胞相互作用导致炎症的基础研究应用.doc
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1、项目名称:病毒与细胞互相作用导致炎症基本研究首席科学家:吴建国 武汉大学起止年限:.1-.8依托部门:教诲部一、核心科学问题及研究内容本项目将以病毒与细胞互相作用为基本,环绕病毒感染导致宿主细胞炎症开展6个方面研究工作。 1、DNA病毒感染导致炎症反映规律 疱疹病毒感染会在机体内上皮组织、角膜、甚至脑内等部位引起炎症,不同部位引起炎症效应细胞和炎症介质是理解炎症发生机制核心。以疱疹病毒为重要研究对象,发现并确认也许与DNA病毒感染有关炎症介质并进一步筛选与疱疹病毒感染有关炎症细胞特异组分,并以此为基本,拟定病毒感染诱发炎症因子表达规律。同步,炎症发生需要外源感染生物、机体炎症有关细胞、炎症因子
2、三方面共同作用,三者有序联系在一起途径即为引起炎症胞内外致炎信号通路。将鉴定信号通路中每一环节细胞因子,逐个确认病毒组分与细胞炎症因子配体和受体、胞内炎症信号传播分子关系,最后确认疱疹病毒引起炎症反映信号通路和也许分子机制。由于疱疹病毒感染机体后能导致裂解性感染和潜伏性感染。不同感染成果导致炎症反映发生又不同,而不同感染成果又与病毒有关感染蛋白互相作用关于。通过对作用于同一炎症因子或相似促炎信号通路疱疹病毒编码蛋白进行协同分析,理解这些有相似致炎作用不同病毒调控蛋白所产生调节炎症发生或病毒感染综合效应,最后构建一种DNA病毒感染与诱发炎症反映初级作用网络模型。 2、RNA病毒感染导致炎症反映规
3、律 以汉坦病毒为重要研究对象,通过对RNA病毒与宿主互相作用研究,着重揭示RNA病毒核酸及其编码蛋白与炎症信号通路中重要分子互相作用机制。在此基本上,进一步分析病毒组分与细胞组分互相作用对炎症产生或消除影响,明确影响炎症转归从而导致严重病理性炎症反映规律。研究宿主细胞在RNA病毒感染诱导炎症反映中对各种炎性细胞向炎症部位和引流淋巴结迁移作用,并运用成熟RNA病毒反向遗传学技术,得到重组流感病毒和水疱性口炎病毒(Vesicular Stommatitis Virus),建立果蝇微量注射感染模型,结合生物学信息模型预测候选基因,从事规模性与炎症信号通路有关活体遗传筛选,鉴定新参加RNA病毒炎症反映
4、信号分子,研究其功能和机制,最后拟定RNA病毒感染与诱发炎症反映规律。 3、非编码RNA调控炎症反映机制 鉴定疱疹病毒和汉坦病毒等基因组内非编码RNA并分析其启动子序列特性,探讨病毒非编码RNA在宿主细胞内表达调控方式。在此基本上,鉴定病毒非编码RNA靶向宿主基因,探讨这些基因编码蛋白对炎症反映调控。同步建立病毒非编码RNA致炎转基因小鼠模型,从整体角度探讨病毒对炎症发生、发展过程调控。在此基本上,从动物水平上,探讨病毒非编码RNA对炎症有关信号通路影响以及对促炎因子和血管生成因子表达调控,进一步理解病毒感染导致炎症分子机制。由于在病毒感染导致细胞炎症信号途径活化过程中,胞内miRNA和lnc
5、RNA表达对于病毒感染导致炎症调控具备重要意义。为此,咱们也将研究胞内miRNA和lncRNA在炎症信号活化过程中表达变化,研究它们对RIG-I炎症信号调控作用和机制。并进一步以炎症因子IL-6和TNF-活化巨噬细胞为模型研究细胞表达非编码RNA对IL-6和TNF-下游信号传导途径调控作用。拟定非编码RNA调控炎症反映作用及机制。4、病毒感染导致炎症反映生物学效应 进一步探讨调控细胞因子风暴产生宿主因子,特别是ADE与天然免疫信号通路互相作用,发现和鉴定一系列影响宿主细胞因子风暴产生编码蛋白及核心位点,明确其调控细胞因子风暴产生分子机制,从而阐明病毒感染导致炎症反映生物学效应,并以转录组学和蛋
6、白质组学为基本,探讨病毒与媒介、病毒与宿主互相作用导致媒介和宿主在感染病毒先后差别表达基因,分析也许涉及到炎症形成因子在DF、DHF和DSS形成过程中作用,同步分析这些因子在病毒感染细胞后对病毒信息反馈,分析这些来源于媒介和宿主数据,寻找它们共性,特别是在病毒感染导致炎症形成方面共性。依照获得数据采用反向遗传学手段验证这些因子对疾病形成、病毒在媒介中持续感染和病毒增殖影响。 拟定流感病毒感染所致炎症有关重要病毒蛋白与核酸及其生物学效应及机制,运用流感病毒体外细胞和小鼠感染模型,对不同亚型流感病毒、流感病毒重组与点突变体诱导炎症反映,细胞因子、炎症有关通路核心分子等进行系统性检测与分析,探讨流感
7、病毒蛋白以及基因组涉及特殊基因成分例如CpG,辨认宿主不同病原辨认受体模式,与炎症核心分子互相作用机制以及导致各种炎症反映生物学效应,以期发现病毒炎症有关蛋白与基因,及其重组与变异对炎症反映影响。同步结合血清等临床中资源,系统分析流感病毒引起炎症有关细胞因子谱,发现和确认导致免疫病理作用核心分子。 5、病毒感染导致炎症致病机理 研究不同形式FN与汉坦病毒包膜糖蛋白互相作用及其对病毒感染影响、TNFR I与3整合素在介导汉坦病毒入胞中作用和互有关系、G2对TNFR I功能与否存在调节作用和3整合素及其有关分子介导汉坦病毒感染血管内皮损伤分子机制,汉坦病毒感染产生炎症细胞因子/趋化因子分子机制。同
8、步以血管内皮细胞或单核巨噬细胞为模型,探讨病毒感染与NF-B途径之间关系以及趋化因子CXCL10(IP-10)在汉坦病毒致病中作用,汉坦病毒及其感染细胞与NK细胞互相作用。澄清IL-17、IP-10、MCP-1等核心炎症反映因子在甲型流感病毒H1N1、H5N1单一及混合感染导致炎症反映过程中作用以及甲型流感病毒感染介导炎症反映共性与个性分子靶标和涉及信号转导通路网络以及补体介导免疫病理损伤在流感病毒致病中作用及其机制。 6、病毒感染导致炎症反映网络调控 以流感病毒为重要研究对象,研究病毒与细胞互相作用导致炎症反映网络调控。在流感不同病程中炎症因子(COX-2、iNOS、IL-32等)表达水平检
9、测及记录学分析;从启动子水平研究流感病毒及其基因产物分别对COX-2、iNOS、IL-32转录调控影响;对COX-2、iNOS、IL-32表达有调控作用转录因子筛选;研究转录调控因子与启动子DNA互相作用;流感病毒感染诱导COX-2、iNOS / IL-32表达信号通路。 IL-32在炎症反映中作用以及与COX-2、iNOS互有关系研究。有炎症活性IL-32剪接异构体筛选;受IL-32调控下游炎症因子筛选和IL-32在炎症网络中生物学功能研究;IL-32与COX-2互有关系研究;IL-32与iNOS互有关系研究;COX-2、iNOS、IL-32在炎症反映网络中上下游关系。COX-2、iNOS、
10、IL-32在炎症网络中调控机制研究。依照前期实验得出这些基因在炎症网络中上下游调控关系,在同上细胞模型中,选取上游基因进行过表达或基因沉默。检测共转下游基因启动子截短和突变报告基因活性,找到受调控转录位点,并进行转录因子与下游基因启动子DNA结合实验,从而拟定上游基因对下游基因表达调控机制;检测与下游基因表达调控有关信号通路影响,拟定上游基因调控下游基因信号通路。进一步开展表观遗传修饰与COX-2、iNOS、IL-32表达调控关系以及甲基化酶参加调控炎症机制研究,涉及:炎症基因甲基化测序和分析,流感病毒和乙肝病毒慢性中甲基化酶调控炎症基因表达变化机制研究等。二、预期目的(一)总体目的 本项目完
11、毕将在病毒感染导致炎症反映基本研究和防治基本研究方面获得具备自主知识产权、领先于国际同类研究创新性成果,提高国内在传染病基本研究领域研究水平和国际影响力,为防治病毒性传染病供坚实理论根据和技术支撑。 (二)五年预期目的 1、分离鉴定新细胞炎症因子 建立一种以大规模基因筛选为基本技术平台,构建果蝇病毒感染模型,结合生物信息学和分子生物学办法和手段,分离与拟定34个与病毒感染导致炎症有关新细胞炎症因子;掌握病毒感染导致细胞炎症因子产生基本规律,并阐明其在病毒感染导致炎症新机制。 2、揭示病毒蛋白和核酸调控炎症作用新机制 以DNA 病毒和 RNA病毒为模式,阐明病毒蛋白和核酸在调控炎症发生、发展与转
12、归中作用机制;揭示病毒蛋白和核酸对干扰素信号通路调控,进而抑制宿主防御,增进病毒自身繁殖机制;充分理解病毒感染导致炎症反映本质因素,阐明病毒对炎症信号通路影响及也许新致病机制。 3、阐明非编码RNA在炎症反映中作用机制 构建病毒非编码RNA转基因小鼠,鉴定一批新病毒非编码RNA,并揭示其影响细胞表观遗传学修饰,从而调控炎症信号通路新机制。完善病毒感染并活化炎症信号传导细胞模型,建立干预非编码RNA表达小鼠模型,研究非编码RNA对小鼠体内病毒感染调控作用;通过大规模测序和深度分析细胞miRNome,拟定病毒感染中,胞内非编码RNA表达谱变化,揭示细胞非编码RNA在炎症信号传导途径、炎症因子表达与
13、释放或炎症因子下游信号途径中调控作用及机制。 4、明确病毒感染导致炎症反映生物学效应 阐明病毒变异对免疫应答与炎症反映生物学效应,揭示病毒感染导致不同炎症反映机制,发现和鉴定一系列诱导ADE效应病毒增强型表位,明确模式辨认信号分子调控ADE基本过程,阐明其诱导炎症反映生物学效应;掌握病毒不同分离株对动物感染性差别以及不同致病性毒株感染导致炎症因子水平差别规律,分析病毒感染导致炎症反映及其对病毒致病性影响;明确病毒感染导致血管内皮细胞损伤分子机制;阐明病毒感染引起细胞因子/趋化因子产生导致炎症及其致病分子机制,明确病毒感染者HLA表型与病毒肽段表位关系,以及CTL辨认不同表位与炎症反映损伤关系;
14、阐明病毒致炎症反映规律以及补体介导免疫病理损伤在流感病毒感染中作用及机制。5、提出病毒感染导致炎症网络调控模型 拟定病毒感染导致表观细胞遗传修饰变化及其在炎症发生发展中作用,明确病毒感染导致炎症核心因子及信号通路互相作用及有关分子机制,构建病毒感染导致炎症作用网络模型。6、获得一批科研成果 在病毒感染导致炎症反映分子机制研究领域获得某些开拓性科研突破,刊登150200篇具备国际影响SCI 收录论文,力求在本领域和国际生物医学顶级刊物刊登影响因子不不大于10论文68篇,获得35项开拓性科研突破;获得一批拥有自主知识产权高水平技术成果,申请国家创造专利1015 项;获得国家级科技奖励12 项;争取
15、获得较好经济和社会效益。7、培养一批人才 培养一批在病毒致炎研究领域具备国际竞争力先进中青年科学家和后备人才。 8、造就一支队伍 造就一支跨学科、跨领域、精诚合伙、团结奋进、开展病毒感染与炎症反映研究专门科研队伍。9、开展学术交流 开展有关国内外学术交流23次。三、研究方案(一)学术思路 1、DNA病毒感染导致炎症反映规律 以已知外源生物诱发炎症反映为借鉴和基本,从DNA病毒感染分子生物学特点出发,理解DNA病毒诱发炎症反映普通规律,以及与老式细菌诱发炎症反映相比共通之处及差别或特点。在掌握DNA病毒所产生有关致炎分子机制后,为该类病毒诱发炎症反映构建一种初级互相作用和信号通路网络。2、RNA
16、病毒感染导致炎症反映规律 诸多RNA病毒通过其自身RNA和编码蛋白对感染机体后诱导炎症反映进行调控,破坏机体对于炎症反映精准调控,进而导致临床上不同症状。本项目拟研究炎症反映有关信号转导机制,在此基本上阐明RNA病毒感染导致炎症反映规律。通过核酸蛋白质或蛋白质蛋白质互相作用,研究病毒诱发炎症普通规律,以及病毒编码蛋白对炎症产生或转归特定过程进行调控,从而导致病理性炎症反映分子机制。 3、非编码RNA调控炎症反映机制 立足于病毒感染导致巨噬细胞胞内非编码RNA表达谱变化,以病毒感染巨噬细胞导致RIG-I炎症信号活化为模型,研究在RIG-I炎症信号活化过程中其他重要非编码RNA表达变化,筛选其中表
17、达差别明显并验证重复性良好非编码RNA。以炎症因子IL-6和TNF-活化巨噬细胞为模型,使用高通量芯片检测此过程中胞内非编码RNA表达谱变化,筛选发生明显表达变化非编码RNA,并通过上述思路探求这些非编码RNA对于IL-6和TNF-下游信号传导途径调控作用;通过体内干预如上非编码RNA,谋求干预病毒感染导致炎症新靶点。在病毒感染小鼠动物模型中,尝试通过干预如上非编码RNA,进而影响RIG-I炎症信号活化导致炎症反映,以谋求体内干预病毒致炎新靶点和新思路。4、病毒感染导致炎症反映生物学效应 立足于国内重要病毒性传染病流行特点,选取登革病毒等为研究对象,聚焦国际前沿科学问题,以病毒与细胞互相作用导
18、致炎症为主线,从细胞和分子水平,开展对病毒感染导致炎症反映生物学效应原创性研究,揭示登革病毒ADE产生规律,登革病毒感染发生炎症反映与其导致DF、DHF和DSS形成机制,以及炎症反映和病毒性脑炎形成机制,为药物和新型疫苗设计提供科学根据。5、病毒感染导致炎症致病机制 炎症是机体对各种损伤性刺激一种防御反映,也是随着各种疾病状态一种共有病理现象。综合采用各种细胞生物学、分子生物学及免疫学技术,以设计周密实验研究为主,结合大量临床标本系统检测,从分子、细胞及整体(涉及实验动物和临床患者)等不同层面和角度,对病毒与细胞互相作用导致炎症及其致病机制开展研究。重要涉及病毒入胞途径中核心分子在感染中作用及
19、其机制,病毒感染导致血管内皮细胞损伤分子机制,固有免疫和特异性细胞免疫应答在病毒致炎症反映及免疫损伤中作用及其机制;病毒感染引起急性肺损伤核心炎症反映因子及其作用机制,补体介导免疫病理损伤在病毒致病中作用及其机制等。 6、病毒与细胞互相作用导致炎症反映网络调控 结合临床数据,综合分析流感病毒感染导致炎症反映中炎症因子表达调控规律,研究病毒核酸和病毒蛋白表达引起炎症基因表达分子机制,炎症因子时序调控规律以及炎症因子互相调控网络,研究新型炎症因子并拟定其在炎症网络中作用。表观遗传修饰变化和蛋白泛素化调控炎症网络机制,为抗炎药物研发打下基本。 (二)技术途径 1、DNA病毒感染导致炎症反映规律 (1
20、) 运用PCR技术构建上述HSV-1复制必须蛋白一系列缺失突变体。 (2) 通过酵母双杂交和免疫共沉淀拟定上述HSV-1复制蛋白-细胞因子详细作用位点。 (3) 接着对病毒复制蛋白基因进行点突变,使上述互相作用蛋白失去互相结合能力但不变化其复制活性区功能。 (4) 通过重组病毒办法重新构建突变病毒;检测感染重组病毒细胞IFN-及其她炎症反映细胞因子水平变化状况;探讨在病毒感染状态下,信号通路活化或抑制与炎症因子表达调节之间关系。 2、RNA病毒感染导致炎症反映规律 (1) 通过病毒与宿主互相作用,研究宿主辨认RNA病毒并产生验证反映规律,着重研究RNA病毒核酸及其编码蛋白通过与炎症信号通路中重
21、要分子互相作用分子机制。 (2) 研究RNA病毒核酸及其编码蛋白通过与炎症产生或消除过程重要蛋白质互相作用,影响炎症转归从而导致严重病理性炎症反映规律。着重研究重要医学病毒编码蛋白对补体系统、花生四烯酸炎症因子调控 ,从而导致严重病理性炎症反映分子机制。 (3) 研究宿主细胞表达LIGHT分子在RNA病毒感染诱导炎症反映中对各种炎性细胞如单核/巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、T细胞向炎症部位和引流淋巴结迁移作用;对免疫保护和免疫病理影响;并摸索其分子机制。 (4) 运用改造病毒建立果蝇微量注射感染模型,结合生物学信息模型预测候选基因,从事规模性与炎症信号通路有关活体遗传筛选,鉴定新参加RNA
22、病毒炎症反映信号分子。 (5) 果蝇RNA病毒感染模型建立:建立不同免疫系统发育阶段果蝇感染模型。并进一步通过组织、细胞、分子水平拟定参加RNA病毒性炎症反映新调节因子。 3、非编码RNA调控炎症反映机制 (1) 运用生物信息学办法,预测病毒基因组中非编码RNA。 (2) 运用RNA免疫沉淀技术,辨承认以与组蛋白甲基化酶互相作用病毒非编码RNA;运用ChIP-seq技术,探讨病毒非编码RNA对宿主染色质重塑。 (3) 运用质谱分析病毒蛋白翻译后修饰,阐明病毒蛋白磷酸化、泛素化修饰对干扰素通路影响;运用表达谱基因芯片技术,探讨病毒非编码RNA对宿主细胞转录组调控。 (4) 构建适合病毒非编码RN
23、A转基因小鼠模型,研究病毒致炎过程及机制。用病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞为细胞感染模型,用病毒直接注射小鼠腹腔或滴鼻作为体内病毒感染模型,观测非编码RNA对病毒感染导致炎症调控作用。 (5) 对于观测RIG-I炎症信号活化导致胞内miRNA或lncRNA表达谱变化,基于已有研究平台,咱们拟使用miRNA芯片和lncRNA芯片筛选炎症过程中发生明显表达差别miRNA或lncRNA。 (6) 使用第二代测序技术深度揭示巨噬细胞miRNome,观测巨噬细胞miRNA表达模式,谋求在巨噬细胞中富集表达miRNA。 (7) miRNA和lncRNA功能研究。通过高表达或抑制有关miRNA或lncRNA,观测
24、其在病毒感染导致RIG-I炎症信号活化模型中对RIG-I下游重要信号分子活化、炎症因子表达和病毒自身复制等方面影响。 (8) miRNA靶基因鉴定技术。使用惯用miRNA寻靶软件如TargetScan或miRanda等搜索有关miRNA也许靶基因,再将这些也许靶基因进行GO或KEGG富集运算,以发现与炎症有关信号通路中核心分子有关也许靶基因。随后,逐个构建如上也许靶基因3UTR荧光素酶报告基因,进一步验证miRNA与靶基因互相作用。 (9) 非编码RNA体内干预技术。在病毒感染小鼠动物模型中,尝试通过干预如上非编码RNA,进而影响RIG-I炎症信号活化导致炎症反映。 4、病毒感染导致炎症反映生
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