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HPLC改善峰形专项方案.doc
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1、三、峰形问题 峰形对称性优劣对峰面积和分离度有很大影响,从而影响分析结果正确性。引发峰形异常原因很多,柱外死体积引发峰形异常有个特点:对先出峰影响大,对后出峰影响小;柱头塌陷、柱头和筛板污染会引发全部峰形全部异常,而硅醇基次级保留只引发部分峰拖尾。相塌陷除了引发保留下降外,也会造成峰拖尾。色谱实践中,大部分峰形问题全部不是色谱柱问题,仪器参数设定、色谱条件和方法正确是否对峰形有很大影响。1.峰后拖常见3种拖尾情况:次级保留引发峰拖尾机了解析:反相色谱中,通常非极性和弱极性化合物能取得良好峰形,而带有COOH、NH2、NHR、NR2等极性基团化合物则比较轻易产生拖尾,原因是硅胶表面残留硅羟基对极
2、性和碱性样品分子产生次级保留效应。 反相填料表面有残余硅羟基,含有一定酸性,其pKa约为4.54.7。依据电离规律,流动相pHpKa2即pH6.7时,99以上硅羟基应该是呈离子状态,即SiO ,而pKapH2即pH2.5时,酸性环境抑制了硅羟基电离,99以上硅羟基应该是呈分子状态,即SiOH,但其极性仍然存在,即SiOH。SiOH和SiO对于极性化合物之间作用力则是一个极性静电作用力,这种作用力比范德华力要强得多。同时,因为硅胶表面键合了C18长链,因为空间位阻作用,样品分子中能接触到残余硅羟基机会不多,只有少部分分子才能和残余硅羟基产生强静电作用而被推迟洗脱出来,产生后拖。拖尾严重程度和样品
3、分子极性大小和残余硅羟基多少有着直接关系。 上图是填料表面示意图,完全硅羟化硅胶表面硅羟基浓度为8?mol/m2,因为空间位阻作用,通常和C18硅烷基发生反应仅达23.5?mol/m2,需要再用小分子硅烷跟硅羟基反应,图中三甲基氯硅烷,使硅羟基中氢变成了三甲基硅烷一个惰性基团。三甲基硅烷还是比氢原子大得多,还是不能将全部残余硅羟基活性封闭掉。 相同样品在不一样品牌柱子上产生拖尾严重性不一样,从填料合成角度而言就是键合密度是否高、封尾是否根本,高密键合和根本封尾能显著降低这种机会,取得良好峰形。Welch企业Ulimate品牌XBC18、AQC18和Xtimate C18采取就是高密键合和根本双
4、峰尾工艺。处理方案:1)先检验样品是否过载,因为样品过载引发峰形后拖不能经过改变色谱条件消除。假如发觉过载,需降低进样量(包含进样体积或浓度),进样量越小,峰形越好,例子如头孢尼西钠测定:2)调整流动相pH将流动相pH调至比弱酸pKa小2以上,比弱碱pKa大2以上,可有效抑制易离子化待测物电离,从而取得良好峰形。例子如二甲基苯氧乙酸测定: 碱性化合物中,甲胺pKa为10.64,那么在pH 8.64时候它是完全呈离子态, 那么pH在2.58.64时,尤其是pH6.78.64时,此时甲胺和硅羟基均以离子状态NH3和SiO形式存在,它们之间相互吸引静电作用造成后拖,这就是为何很多碱性化合物在pH 7
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