油茶(camellia—oleifera—abel)三萜皂苷的分离纯化.doc

青岛农业大学毕业论文题 目：油茶（Camellia oleifera Abel）三萜皂苷的分离纯化姓 名： 346767 学 院： 园艺学院 专 业： 茶 学 班 级： 2010级1班 学 号： 20103324 指导教师： 张新富 2014年6月15日目 录摘要1Abstract2引言31 材料与方法51.1材料与试剂51.1.1试验材料51.1.2试验试剂51.2 仪器与设备51.3 试验方法51.3.1大孔树脂分离纯化油茶三萜皂苷51.3.2硅胶柱分离油茶三萜皂苷61.3.3硅胶柱二次分离油茶三萜皂苷71.3.4 ODS-C18OPN分离纯化油茶三萜皂苷71.3.5 ODS-C18OPN二次分离纯化油茶三萜皂苷81.3.6 HPLC分离纯化82 结果与分析82.1 油茶三萜皂苷分离纯化流程图82.2 AB-8大孔树脂纯化油茶三萜皂苷102.3 硅胶柱层析纯化油茶三萜皂苷112.4 ODS-C18OPN分离纯化油茶三萜皂苷122.5 HPLC分离油茶三萜皂苷单体组分133 结论与讨论143.1 AB-8大孔树脂、硅胶层析分离纯化油茶三萜皂苷143.2 ODS- C18OPN分离纯化143.3 HPLC分离纯化14参考文献16致谢18油茶（Camellia oleifera Abel）三萜皂苷的分离纯化 茶学专业 冯钰 指导老师 张新富摘要：从天然产物中寻找全新结构的活性物质是现代科学研究的一大趋势，三萜皂苷是其中的热点。油茶三萜皂苷是油茶饼粕中主要的活性成分，但其单体的相关报道较少。本研究以油茶三萜皂苷粗品为材料，利用AB-8大孔树脂吸附油茶三萜皂苷，30%乙醇洗脱出色素等杂质，80%乙醇洗脱出油茶总皂苷，得率为16.6%；硅胶柱进一步分离纯化油茶三萜皂苷，洗脱系统为二氯甲烷：甲醇：水=65:50:8，得率为64.73%；ODS-C18OPN纯化油茶三萜皂苷，50%甲醇洗脱出杂质组分，60%、65%、70%甲醇洗脱出油茶三萜皂苷的不同组分，得率分别为11.76%、23.45%、49.25%，其纯度进一步得到提高；HPLC分离油茶三萜皂苷，0.2%乙酸-乙腈系统进行洗脱，得到两个单峰组分。单体化合物的获得为油茶三萜皂苷构效关系的研究奠定了基础。关键词：油茶；三萜皂苷；分离；大孔树脂；液相色谱分析The Application Separation and Purification Technologies of Camellia oleifera AbelStudent majoring in tea science Feng YuTutor Zhang Xin-fuAbstract: Looking for new active substances from natural products is a major trend in modern scientific research, and triterpenoid saponins is one of the hot spots. Triterpenoid saponins are the main active components in tea seed pomace (Camellia oleifera), which are very few reports describing successful isolation of saponin monomers. In this study the crude saponins were firstly subjected to AB-8 macroporous resin column chromatography with stepwise gradients of ethanol and water (at rations of 30:70, 80:20, v/v), its yield is 16.6%; Then triterpenoid saponins were purified by silica gel column with the elution system (dichloromethane: methanol: water =65:50:8), the yield is 64.73%; Triterpenoid saponins were further purified by ODS-C18OPN, 50% methanol eluting the impurity components, and 60%, 65% and 70% methanol eluting different saponins, the rates were 11.76%, 23.45% and 49.25% respectively, so the purity of saponins is further improved; Finally triterpenoid saponins were purified by HPLC, 0.2% acetic acid acetonitrile system for elution, two single components were isolated. The obtaining of monomer compounds has laid the foundation for the research of triterpenoid saponins structure-activity relationship.Keywords: Camellia oleifera; triterpenoid saponin; separate; macroporous resin; High Performance Liquid Chromatograph (HPLC) 引言油茶（Camellia oleifera Abel）是山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）植物，是我国特有的木本食用油料树种。茶皂苷，也可称为茶皂素、茶皂甙，是一类结构较为复杂的齐墩果烷型五环三萜类皂甙混合物，是由皂甙元、糖体和有机酸三部分作为基本结构组成的1,2。油茶籽粕中茶皂苷的含量为10%左右，茶皂苷可以从油茶饼粕中提取而得，是一种具有优良性能的天然非离子型表面活性剂，具有良好的的表面活性以及生物活性，其乳化、发泡、润湿、分散作用显著，并具有溶血、消炎镇痛、抗渗透、抗氧化、抑菌杀虫等生物活性3，因而被广泛应用于水产养殖业、日用化工业、农业生产、建筑业、医药行业、食品加工等各个领域4,5。油茶皂苷传统提取工艺分为两类：水浸法、有机溶剂浸出法3，有机溶剂提取油茶皂素的方法常用于工业中，主要包括过膜法、萃取法、沉淀法、大孔树脂层析法等，但是此类方法分离后纯度较低，其中还会掺杂糖类、蛋白质、色素等杂质，后期还需进行更细致地分离纯化6。目前关于油茶皂苷的分离纯化方法主要有柱层析法、薄层层析法、高效液相色谱分离法等7。水浸法生产油茶皂苷成本低、无污染、投资少、生产简便、见效快，不需用有机溶剂，但是生产油茶皂苷的效率低，产物杂质多，并且损耗大，造成提皂后残渣的营养成分大量流失，降低了提皂后残渣的可饲用性。有机溶剂浸出法生产油茶皂苷效率高、能耗少，产品杂质含量少，但产品成本高、设备复杂、溶剂损耗大，并且用甲醇提取时若设备密封不好会因甲醇挥发而造成对人体的毒害6,7。薄层层析法对于结构相似的成分不能达到较好的分离效果；高效液相色谱分离法虽然灵敏度高、分离速度快，但需要较为完备的仪器设备，并且得到的色谱峰较为集中，分离度较低，保存时间短8。大孔树脂层析法是柱层析法的一种，运用树脂提取分离油茶皂苷的生产工艺是采用水浸提法，利用树脂所具有的选择吸附性能来富集、分离油茶皂苷，用一定浓度的乙醇溶液进行洗脱，回收洗脱剂可获得较纯的油茶皂苷粗品9。研究发现，离子交换树脂对油茶皂苷的吸附容量较高，洗脱率相对较低。张新富等（2012）采用了不同孔径、不同比表面积的大孔树脂进行对比分析实验，结果表明：与其他几种型号的树脂相比，AB-8大孔树脂对油茶皂苷的吸附率和洗脱率较强，均达到85%以上，而且使用不同浓度梯度的乙醇溶液进行解吸时可以有效除去色素、糖类、蛋白质、黄酮类等杂质10。因此选择AB-8大孔树脂层析法纯化油茶皂苷，利用该树脂以水洗脱可以得到色素、茶多糖和蛋白质，30-40 的乙醇洗脱得到茶多酚和黄酮，60左右的乙醇洗脱可得到油茶皂苷，继而可以使茶叶中所含的多糖、色素、蛋白质、茶多酚、油茶皂苷等初步分离开来10-12。HPLC分离纯化技术是目前较为先进的油茶皂苷分离技术，其灵敏度高、分离速度快，多用于油茶皂苷的最终分离13-15。关于茶皂苷单体的报道，研究材料主要集中在茶树（Camellia sinensis）的根、叶、花和种子。关于茶皂苷的探索开始于19世纪末，日本名为青山新次郎的学者在1931年初次从茶树种子中提取出茶皂苷，命名为“Saponin”，而且在其水解实验中得到了糖体以及配基，使茶皂苷实验式的确定成为可能，但是他并没能够从中提取分离出茶皂苷纯结晶1。在随后的几十年里，Masayuki等人对茶树的叶、根、花和种子进行深入研究后分离纯化出56种油茶三萜皂苷单体。1952年，日本石馆守山以及上田阳在茶籽中提取分离出茶皂苷晶体，并确定了茶皂苷的结构组成：皂甙元（C30H50O6）与当归酸以及糖体（包括半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸）相结合16。在20世纪60年代之后，随着科学技术的不断发展以及科研人员的不懈探索和研究，茶皂苷的研究得到了进一步的发展，高分子技术的不断优化让茶皂苷化学结构的确定成为可能，高灵敏仪器陆续诞生，茶皂苷的分离鉴定分析方法和分离纯化技术也在不断提高。目前，高效液相色谱和反相高压液相色谱与质谱相结合已成为分离鉴定茶皂苷的常用方法，尤其是核磁共振技术在茶皂苷单体结构研究领域的应用，为皂苷结构的鉴定提供了便利8。近年来，逐渐报道了一些油茶（Camellia oleifera）和茶梅（Camellia sasanqua）中的茶皂苷，Huang等从油茶（Camellia oleifera）饼粕中分离鉴定出一个皂苷物质sasanquasaponin（C58H92O26，SQS），并研究了它对缺氧损伤内皮细胞的作用17；KUO等从油茶（Camellia oleifera）饼粕中分离了一个茶皂苷混合物，并研究了它对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的作用18；Sugimoto等从油茶（Camellia oleifera）的花芽中分离鉴定了四个皂苷化合物yuchasaponins A、B、C、D，并以小鼠为模型研究其对胃的保护作用19；MATSUDA等从茶梅（Camellia sasanqua）的花中分离了5个皂苷sasanquasaponin -，并研究了它们的生物活性20。油茶（Camellia oleifera）中三萜皂苷的报道远远少于山茶属其他植物，存在很大的研究空间。本研究以油茶三萜皂苷粗品为材料，采用柱层析法分离纯化油茶三萜皂苷，在大孔树脂初步纯化后将所得样品再进行硅胶柱、ODS-C18OPN柱的分离纯化，最后经HPLC分离得到油茶三萜皂苷单体组分。1 材料与方法1.1材料与试剂1.1.1试验材料实验室前期获得的油茶三萜皂苷粗品。1.1.2 试验试剂表1 试验试剂一览表Table 1 List of experimental reagents试剂名称规格（型号）生产厂家乙醇（95%）甲醇二氯甲烷硫酸铈硫酸硅胶板大孔树脂柱层层析硅胶薄层层析硅胶HODS-C18OPN分析纯 AR分析纯 AR分析纯 AR分析纯 AR分析纯 AR试剂级AB-8型试剂级（100-200目） （200-300目）化学纯化学纯莱阳康德化工有限公司天津市广成化学试剂有限公司天津市富宇精细化工有限公司天津市登科化学试剂有限公司上海山浦化工有限公司莱阳康德化工有限公司青岛胜海精细硅胶化工有限公司沧州宝恩吸附材料科技有限公司青岛胜海精细硅胶化工有限公司青岛胜海精细硅胶化工有限公司青岛海洋化工有限公司日本YMC 1.2 仪器与设备HPLC（Agilent 1260）、大孔树脂吸附柱（1003.5 cm、1005 cm）、硅胶柱（1005 cm）、ODS-C18OPN柱（503.0 cm）、旋转蒸发仪、数显恒温水浴锅、电热鼓风干燥箱、水循环真空泵、冷冻干燥机、吹风机、电子称、烧杯、玻璃棒、注射器、毛细管、脱脂棉、纱布等。1.3 试验方法1.3.1 大孔树脂分离纯化油茶三萜皂苷本研究选用AB-8大孔树脂初步分离纯化油茶三萜皂苷，其步骤如下：（1）装柱：称取AB-8大孔树脂：柱1100 g；柱540 g，各用95%浓度的乙醇浸泡四小时以上。柱规格为1005.0 cm，柱为1003.5 cm，装柱前在旋钮端柱口处塞上脱脂棉以防止大孔树脂下漏，将浸泡好的大孔树脂搅拌均匀后倒入柱内，装柱时要注意柱内的乙醇高度要高于大孔树脂，否则树脂内会进入气泡，影响大孔树脂的吸附效果。（2）蒸馏水洗脱：用蒸馏水冲柱，洗脱前要在柱内树脂层上放入用纱布包好的脱脂棉，防止加水时树脂翻起。（实验现象：放置一晚后柱内出现少量气泡，加水洗脱后树脂高度降低，柱内气泡减少，树脂柱进一步紧实。）（3）浸样：称取600 g油茶三萜皂苷粗品用蒸馏水浸泡，搅拌使其溶解均匀。（4）上样：将浸好的粗样分别倒入两个柱内，打开旋钮，等整个柱子变色、流出液中泡沫丰富时说明吸附完全。（5）洗脱：先用蒸馏水洗脱至流出液为浅黄色，再分别用30%、80%、95%浓度的乙醇梯度洗脱，30%乙醇的加入量约为柱容积的4-5倍，流出液先为红褐色然后逐渐变浅，用80%乙醇洗脱时要收集洗出液，洗脱到柱底接近无色为止，最后用95%乙醇充分洗脱并收集洗出液。（6）旋转蒸发：在55 下将收集的洗出液旋转蒸发，再用水浴锅进一步蒸干浓缩，浓缩液要抽滤除掉其中的残渣。（7）冷冻干燥：将洗脱液分装到小烧杯（150 ml）中，用保鲜膜封口后冷冻，全部凝固后在保鲜膜上刺多个小孔进行冷冻干燥（-50 ），抽真空时烧杯中会产生泡沫，干燥后的样品（样品A）为浅黄色固体。1.3.2硅胶柱分离油茶三萜皂苷（1）配制洗脱液：二氯甲烷：甲醇：水=65:50:8。（2）装柱：称取硅胶（100-200目），柱(1005.0 cm) 478 g、柱(1005.0 cm) 522 g，分别用适量洗脱液浸泡并搅拌均匀赶出气泡。装柱前先在柱内倒入部分洗脱液作为缓冲，装柱时要一气呵成，否则会有断层。分别量取2500 ml的洗脱液循环冲柱，使硅胶压的更紧实，最终硅胶柱高约80 cm。（3）拌样：各称取15 g样品A于小烧杯中，加少量甲醇溶解，再各称取15 g硅胶于研钵中，放于水浴锅（60）上，将溶解的样品缓慢倒入并搅拌均匀，加热后得到干物质共63 g，研成粉末。（4）湿法上样：将上步研磨得到的粉末装柱，柱 29.6 g、柱 33.4 g，再在样品上各加10 g硅胶，防止倒入缓冲液时冲起样品。注意硅胶和样品的铺面一定要平整，这样才能使样品中的洗脱物均匀下沉。（5）洗脱：待含颜色的物质接近旋钮口时开始收集流出液（每500 ml一组），并做好标注。（6）干燥：每组分别进行旋转蒸发，直到流出液蒸发后无明显物质为止，每根柱子各冲出15个组分。最后将所有组分水浴浓缩、冷冻干燥得样品B。（7）点板显色：从中选出质地均匀、颜色较浅的组分，各取少许经甲醇溶解后用毛细管吸取适量点在硅胶板一侧，注意点的大小和颜色，各组分所点的大小要均匀一致，点的颜色较浅时要多点一些。用吹风机吹干后将硅胶板放于装有缓冲液（二氯甲烷：甲醇：水=65:50:8）的密封瓶中层析，再次吹干后均匀地喷上显色剂，最后放于电热鼓风恒温干燥箱中以120加热显色约1 min。显色剂的配制：称取0.5 g硫酸铈溶于50 ml 浓度为10%的硫酸溶液中。观察显色程度，用作分组参考。1.3.3硅胶柱二次分离油茶三萜皂苷（1）装柱：在样品B中，每根柱子的2号组分质量最多且质地均匀、色泽较浅，柱-2为9.4 g、柱-2为12.6 g。重装两根硅胶柱（柱、柱），每根柱用430 g硅胶（200-300目）。（2）洗脱：缓冲液配制为二氯甲烷：甲醇：水=65:50:6，装柱后用缓冲液洗脱柱子，待硅胶柱压紧实后测得两根柱子都高约72 cm。（3）湿法上样：分别将柱-2、柱-2组分用甲醇溶解，经有机膜过滤后各用7 g 硅胶拌样，分别上样后每根柱子加10 g保护硅胶。（4）干燥：用缓冲液冲至流出液经旋转蒸发后无明显物质为止，旋转蒸发、冷冻干燥后，柱得9个组分（共8.5876 g）、柱得8个组分(共10.8314 g)。（5）液相分析：挑选色泽较白、质地均匀的组分进行液相分析。1.3.4 ODS-C18OPN分离纯化油茶三萜皂苷（1）样品选择：经液相分析后，通过观察比较各组分样品的液相图进行分组，将柱-3至-7和柱-1至-7合并（共16.996 g）。防死吸附：用甲醇溶解，经滤纸抽滤和有机膜过滤后先用少量C18分离，防止死吸附现象，避免污染后面的整根ODS-C18OPN柱，以纯甲醇为洗脱液，将流出液进行蒸发浓缩、有机膜过滤后得到备用样品溶液（60 ml）。（2）装柱：将C18(112.5 g）装柱，先用纯甲醇冲洗柱子使其更加紧实，再用50%浓度的甲醇将柱内纯甲醇置换出，将样品溶液分四次上样。（3）洗脱：分别用50%、60%、65%、70%、100%浓度的甲醇梯度洗脱，每梯度400 ml，将柱、柱剩余组分合并作为第5次上样，每次上样前需将ODS-C18OPN柱冲成50%的甲醇浓度，从而使柱内溶液浓度与第一个洗脱梯度的浓度相同，各收集5个组分。（4）干燥：将最终冲出的25个组分别进行旋转蒸发、水浴锅浓缩和冷冻干燥后得到样品C。（5）液相分析：将得出的固体组分进行液相分析，得到的液相分析图作为下一步中样品选择的依据。1.3.5 ODS-C18OPN二次分离纯化油茶三萜皂苷（1）样品合并：从样品C中选出组分1-4、2-4、3-4、4-4合并（共2.389 g），并用甲醇溶解，有机膜过滤。（2）洗脱：将上步所用的ODS-C18OPN柱用50%的甲醇饱和，上样后分别用60%(450 ml)、65%（600 ml）、100%（600 ml）浓度的甲醇梯度洗脱，流出液需分组收集，60%的流出液全部收集为一组；65%的流出液分3组收集，每组200 ml；100%的先收200 ml ，剩余的为一组，共得出6个组分。（3）干燥：将所得的6个组分经旋转蒸发、冷冻干燥后共得1.6159 g样品。（4）各组分的HPLC分析。1.3.6 HPLC分离纯化 通过观察经ODS-C18OPN柱分离纯化后所得组分的液相分析图判断油茶三萜皂苷的分离纯化程度，选择峰较明显、峰的数量较少的组分进一步进行HPLC分离纯化。 HPLC条件：Aglilent Zorbax Eclipse Plus C18(250 mm4.6 mm, 5 m)色谱柱，检测波长：280 nm，柱温箱温度设定：25，流速1.0 mLmin，A相：0.2%乙酸，B相：乙腈，0-10min B相由35%升至38%，20min升至42%。2 结果与分析2.1 油茶三萜皂苷分离纯化流程图旋转蒸发、冷凝干燥柱旋转蒸发、冷凝干燥柱油茶三萜皂苷粗样900 g蒸馏水浸泡AB-8大孔树脂（柱：1100 g；柱:540 g）吸附柱：1.0 L柱: 0.7 L柱：2.85 L柱: 2.55 L柱：3.0 L柱: 2.7 L柱：0.5 L柱: 0.3 L水、乙醇（30%、80%、95%）梯度洗脱蒸馏水洗脱30%乙醇洗脱80%乙醇洗脱95%乙醇洗脱弃去（蛋白、色素、黄酮类）得油茶三萜皂苷粗样149 g,取30 g弃去（色素、糖类）旋转蒸发、冷凝干燥每500 ml一个组分，共30个组分（柱：15个;柱15个）:洗脱液：CH2Cl2:CH3OH:H2O (65:50:8）甲醇溶解，30 g硅胶拌样，1 kg硅胶（100-200目）湿法装柱(柱：478 g;柱:522 g)洗脱液浸泡，搅匀装柱fr11.02 g咖啡色粉末fr2-fr512.16 g黄白色粉末 fr6-fr100.41 g棕色粉末 fr110.21 g浅棕色粉末 fr12-fr150.23 g深棕色粉末 柱柱fr11.08 g咖啡色粉末fr2-fr413.67 g黄白色粉末 fr5-fr110.51 g棕色粉末 fr12-fr150.32 g深棕色粉末 洗脱液：CH2Cl2:CH3OH:H2O (65:50:6）洗脱每500 ml一个组分，共9个组分柱fr2:9.4 g，甲醇溶解，7 g硅胶拌样，430 g硅胶（200-300目）湿法装柱（柱）fr1-fr2黄色粉末含部分晶体fr3米白色粉末fr4-fr6黄白色粉末 fr7-fr9浅黄色粉末 洗脱液：CH2Cl2:CH3OH:H2O (65:50:6）洗脱每500 ml一个组分，共8个组分柱fr2:12.6 g，甲醇溶解，7.5 g硅胶拌样，430 g硅胶（200-300目）湿法装柱（柱）fr1黄色粉末fr2米白色粉末 fr3-fr5黄白色粉末 含部分晶体 fr6-fr8浅黄色粉末 含部分晶体 柱-3至-7和柱-1至-7合并（共16.9 g）,甲醇溶解，过ODS-C18OPN柱,分4次上样分别用50%、60%、65%、70%、100%的甲醇梯度洗脱，每梯度450 mlfr1:0.6903 g浅棕黄色粉fr2:0.3481 g米白色晶体fr3:0.1696 g白色晶体fr4:0.6901 g白色晶体fr5:2.1241 g米白色晶体fr1:0.0623 g浅棕黄色粉末fr2:0.0633 g米白色晶体fr3:0.4606 g白色晶体fr4:0.5553 g白色晶体fr5:0.9031 g白色粉末fr1:0.0471 g浅棕黄色粉末fr2:0.0895 g白色粉末fr3:0.5056 g白色粉末fr4:0.5238 g白色晶体fr5:0.6462 g白色粉末fr1:0.0185 g白色晶体fr2:0.1810 g 白色晶体fr3:0.2278 g 浅黄色晶体0.0793 g白色粉末fr1:0.7217 g白色粉末（含少量晶体）fr2:0.3876 g 白色晶体分别用60%、65%、100%甲醇（450 ml、600 ml、600 ml）梯度洗脱将-4、-4、-4、-4合并（共2.389 g），60%甲醇溶解，重过ODS-C18OPN柱60%(450 ml一个组分)100%（分200 ml400 ml两个组分）65%（每200 ml一个组分）fr1:0.0312 g浅棕黄色粉末fr2:0.0918 g浅黄色粉末fr3:0.1277 g米白色晶体fr4:0.8797 g白色晶体fr5:0.0526 g 白色晶体HPLC分离纯化得到两个油茶三萜皂苷单体组分本研究以油茶三萜皂苷粗品为原料，分别经过AB-8大孔树脂初步纯化、硅胶（100-200目）分离纯化、硅胶（200-300目）二次分离纯化、ODS-C18OPN分离纯化、ODS-C18OPN二次分离纯化、HPLC分离纯化后得到油茶三萜皂苷单体组分。2.2 AB-8大孔树脂纯化油茶三萜皂苷油茶三萜皂苷粗品900 g，经过AB-8大孔树脂初步纯化后得到149 g样品，其得率为16.6%。图1中A组为AB-8大孔树脂纯化前的样品，B组为纯化后，图左侧为TCL分析，点板显色中可明显看出B组中没有A组标号为1、2、4处的杂质显色反应，而两组中所共有的3号则主要表示油茶三萜皂苷的显色反应。右侧为液相分析图谱，相较于A组，B组中10 min之前的杂峰明显减少，说明部分杂质被除去。TCL分析和液相分析说明AB-8大孔树脂吸附法能够有效地去除油茶三萜皂苷粗品中的部分杂质。12ABBA12334图1 TLC和HPLC 分析Fig.1 TLC and HPLC analysis 2.3 硅胶柱层析纯化油茶三萜皂苷样品A经硅胶（100-200目）分离纯化后共得30个组分，从中选出质地均匀、颜色较浅的组分点板显色，经点板显色分析后选出每根柱子的2号组分（共22 g）通过硅胶(200-300目)进行二次分离纯化，共得到17个组分（共19.419 g），见表2。两次硅胶柱层析纯化油茶三萜皂苷后的最终得率为64.73%。表2 硅胶二次分离纯化后所得组分（单位/g）Table 2 Components obtained after the secondary purificated by silica gel (units / g)123456789合计柱1柱20.27630.70982.01054.24341.4463.64012.5241.33341.82970.4430.34290.17550.08480.22340.05730.06280.01618.587610.8314将经硅胶（100-200目）分离纯化与硅胶（200-300目）二次分离纯化后的对应组分进行液相分析，由图2可见，经硅胶二次分离纯化的组分在10min之前的杂峰明显减少，说明硅胶二次分离纯化油茶三萜皂苷可进一步除去部分杂质。硅胶（100-200目）分离纯化硅胶（200-300目）二次分离纯化图2 液相分析对比图Fig.2 Analysis of liquid phase comparison chart2.4 ODS-C18OPN分离纯化油茶三萜皂苷选择液相图相似的组分合并进行ODS-C18OPN分离纯化后得到25个组分，见表3。五组样品上样前共19.419 g，经ODS-C18OPN分离纯化后所得样品总量为9.7579 g，得率为50.25%，流失较多，主要原因有：样品经滤膜和有机膜过滤时有损失；ODS-C18OPN柱中仍含有部分样品；转移称重时有损耗等。表3 ODS-C18OPN柱分离纯化后所得组分（单位/g）Table 3 Components purified and separated by ODS-C18OPN column (units / g)上样次数 洗脱梯度50%60%65%70%100%合计第一次第二次第三次第四次第五次0.04710.03120.06230.69030.02190.08950.09180.06330.34810.05350.50560.12770.46060.16960.02480.52380.87970.55530.69010.05650.64620.05260.90312.12410.53921.81221.1832.04464.02220.69599.7579ODS-C18OPN二次分离纯化后得到三组较纯的油茶三萜皂苷组分(共1.6159 g)，60%甲醇洗脱的流出液全部收集为一组；65%甲醇洗脱后分3组收集，每组200 ml；100%甲醇洗脱后先收200 ml,剩余流出液合为一组，共得出6个组分，得率为67.64%。根据液相分析图，从两次ODS-C18OPN分离纯化所得的组分中挑选出单峰明星的组分，便于后期的单峰分离。 表4 ODS-C18OPN二次分离纯化后所得组分（单位/g）Table 4 Components obtained after the secondary purificated by ODS-C18OPN (units / g)组分个数洗脱梯度123合计60%甲醇65%甲醇100%甲醇0.07930.01850.72170.1810.38760.22781.6159图3 ODS-C18OPN分离纯化油茶三萜皂苷Fig.3 Triterpenoid saponins purified by ODS-C18OPN2.5 HPLC分离油茶三萜皂苷单体组分经过ODS-C18OPN分离纯化后通过观察液相分析图选出两个杂峰少、色谱峰明显的组分的组分进一步进行HPLC分离纯化，得到了两个油茶三萜皂苷单体组分，液相分析图显示出明显的单峰，出峰时间分别为9 min和14.5 min。图4 HPLC分离纯化油茶三萜皂苷 Fig.4 Triterpenoid saponins purified by HPLC3 结论与讨论3.1 AB-8大孔树脂、硅胶层析分离纯化油茶三萜皂苷AB-8大孔树脂对油茶三萜皂苷具有较高的吸附率和洗脱率，且材料使用方便，成本相对较低。用不同浓度的乙醇分梯度进行洗脱可实现油茶三萜皂苷的初步分离纯化，利用该树脂以水洗脱可除去色素、茶多糖和蛋白质，30-40 的乙醇洗脱可除去茶多酚和黄酮，60左右的乙醇洗脱可得到油茶三萜皂苷，继而可以使材料中所含的多糖、色素、蛋白质、茶多酚、油茶三萜皂苷等初步分离开来。900 g油茶三萜皂苷粗品经AB-8大孔树脂初步纯化后得到149 g样品，得率为16.6%。以硅胶柱湿法上样，二氯甲烷：甲醇：水=65:50:8作为洗脱剂进行洗脱可进一步纯化油茶三萜皂苷，将油茶三萜皂苷冲出柱外，部分杂质被吸附在柱内。本研究前后共进行了两次硅胶柱吸附，第一次采用100-200目硅胶，为了进一步分离纯化油茶三萜皂苷，第二次采用200-300目硅胶进行吸附，两次硅胶柱层析纯化油茶三萜皂苷后的最终得率为64.73%，油茶三萜皂苷样品得到了进一步的纯化。3.2 ODS- C18OPN分离纯化采用ODS-C18OPN层析柱，可进一步吸附部分硅胶柱所不能吸附的杂质，以不同浓度的甲醇溶液作为洗脱剂再次分离纯化油茶三萜皂苷样品，50%甲醇洗脱出杂质组分，60%、65%、70%甲醇洗脱出油茶三萜皂苷的不同组分，得到的油茶三萜皂苷样品色泽更白，质地更接近结晶状。3.3 HPLC分离纯化液相色谱法灵敏度高，分离速度快，最终通过液相色谱法分离纯化后得到了两个油茶三萜皂苷单体组分，液相分析图显示出明显的单峰，出峰时间分别为9 min和14.5 min，得到的油茶三萜皂苷样品为纯白色晶体。参考文献1 宛晓春. 茶叶生物化学M. 北京:中国农业出版社, 2003:58-62.2 POTTER D A, REDMOND C T, MEEPAGALA K M, et al. Managing earthworm casts (oligochaeta: Lumbricidae) in turfgrass using a natural byproduct of tea oil (camellia sp.) manufactureJ. Pest Manag Sci, 2010, 66(4): 439-446.3 姜勤. 油茶三萜皂苷的生产与应用.广西师范大学学报（自然科学版）, 1990, 8(2) :49-53.4 PING-CHUNG KUO, TSUNG-CHUN LIN, CHENG-WEI YANG et al. Bioactive Saponin from Tea Seed Pomace with Inhibitory Effects against Rhizoctonia solani J. Food Chem, 2010, 58: 86188622.5 Michiko Myose, Tsutomu Warashina, Toshio Miyase. Triterpene Saponins with Hyaluronidase Inhibitory Activity from the Seeds of Camellia sinensis. Chem.harm.Bull. 2012, 60(5): 612-623.6 叶雪良.茶皂苷的开发与利用J. 化工生产与技术, 2002, 9(2):6-9.7 张国运, 曹丽云, 吴建鹏, 等. 茶皂素提取工艺及其应用研究进展J. 日用化学工业, 2006, 36 (3):174-177.8 尹丽茸, 张建华, 宋光艳, 等. HPLC-TOF-MS测定茶籽粕中的茶皂素主要成分J. 中国粮油学报, 2013, 28(12):97-101.9 曾韬, 毕梦宇, 李尤山, 等. 茶皂素的提取研究J