野鼠中猪圆环病毒2型毒株的分离鉴定及其基因变异情况分析.pdf
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1、DOI:10网络首发时间:2 0 2 3-10-172024,54(01):87-92中国兽医科学2024,54(01)ChineseVeterinary Science16656/j.issn.1673-4696.2024.0014中图分类号:S852.659.2文献标志码:A文章编号:16 7 3-46 9 6(2 0 2 4)0 1-0 0 8 7-0 6野鼠中猪圆环病毒2 型毒株的分离鉴定及其基因变异情况分析孟晨光1,2,喻蓓蕾1,2,王开心1,2,彭小烨1,2,谭磊12,蒋一凡1,2,彭璇1,3,麦金辉1,2*(1.湖南农业大学动物医学院,湖南长沙410 12 8;2.兽用蛋白质工程
2、疫苗湖南省重点实验室,湖南长沙410128;3.长沙市望城区动物疫病预防控制中心,湖南长沙410000)摘要:湖南省某规模化猪场妊娠母猪发生由PCV2感染引起的繁殖障碍,为了解猪场周围野鼠PCV2感染及其基因变异情况,本研究采用PCR法检测从该场采集的猪血液及该场周边的野鼠组织样品中是否存在PCV2核酸;扩增PCV2阳性样品全基因组并测序,分析鼠源和猪源PCV2全基因组的同源性与遗传进化关系,对野鼠源PCV2(HNRCV株)进行分离与鉴定。结果表明,该场母猪和周边野鼠存在PCV2感染,且猪源和野鼠源PCV2全基因组序列(17 6 7 bp)的同源性为10 0%;同源性与遗传进化分析结果表明,湖
3、南HNRCV分离株与美国毒株2 2 6 2 5-33的同源性最高(99.8 9%),同属于PCV2d,且Cap基因的同源性为99.7 2%;在野鼠组织中成功分离出HNRCV株,并且该分离株可在PK-15细胞中增殖。本研究结果提示,野鼠在猪场中PCV2的流行与传播发挥着重要作用,为PCV2的防控提供科学依据关键词:猪圆环病毒2 型;野鼠;检测;分离鉴定Isolation and genetic analysis of porcine circovirus 2 strain isolatedfrom the wild miceMENG Chenguang-2,YU Beileil-2,WANG K
4、aixin-2,PENG Xiaoye-2,TAN Lei2,JIANG Yifan-2,PENG Xuanl:3,MAI Jinhuil,2*(1.College of Veterinary Medicine,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Hunan Provincial KeyLaboratory of Protein Engineering in Animal Vaccines,Changsha 410128,China;3.Changsha Wangcheng District AnimalDisease P
5、revention and Control Center,Changsha 410000,China)Abstract:Reproductive abnormalities caused by porcine circovirus 2(PCv2)infection were observedin sows within a large-scale pig farm situated in Hunan Province.To understand the biology of theinfection and identify genetic mutations in PCv2 in wild
6、mice around the pig farm,we evaluated thepresence of PCv2 nucleic acid in the blood samples collected from the pigs on the farm and thetissue samples from the wild mice around the farm using polymerase chain reaction(PCR).The wholegenome of PCv2-positive samples was amplified and sequenced;furthermo
7、re,the whole genomes ofPCv2 of murine and porcine origins were analyzed for sequence homology and genetic evolutionaryrelationships.Finally,PCV2(HNRCV strain)from wild mice was isolated and identified.PCV2 infectionsin sows on the farm and wild mice in the neighborhood were found,and the homology of
8、 the wholegenome sequences of PCv2(1 767 bp)detected in pigs and wildmice was 100%.The results from the analysesof sequence homology and genetic evolutionary relationships indicated that the isolated HNRCv收稿日期:2 0 2 3-0 7-0 4;修回日期:2 0 2 3-10-10基金项目:湖南省自然科学基金项目(2 0 2 2 JJ30298)作者简介:孟晨光(198 8-),男,吉林通化
9、人,硕士,主要从事动物临床疫病防控研究,E-mail:m c g v e t 16 3.c o m。*通讯作者:麦金辉,博士,主要从事兽医临床微生物组与生物技术研究,E-mail:j i n h u i ma i s t u.h u n a u.e d u.c n。88第54卷中国兽医科学strain from Hunan Province exhibited the highest level of homology(99.89%)with the U.S.strain22625-33.The PCV2d genotype served as the foundation for both
10、these strains andanotable 99.72%homologywas evident within the Cap gene.The HNRCV strain was successfully isolated from the wild mousetissue samples and could proliferate in PK-15 cells.The results of this study suggest that wildmice play an important role in the prevalence and transmission of Pcv2
11、in pig farms,thus providinga scientific basis for the prevention and control of PCv2.Key words:porcine circovirus 2;the wild mice;detection;isolate and identification*Corresponding author:MAI Jinhui,E-mail:猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)是目前已知最小的无囊膜、单股正链、环状DNA病毒,属于圆环病毒科、圆环病毒属,根据PCVs基因组特征,目前将其分为PCV1、PCV
12、2、PCV3和PCV41-2PCV2感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemic wasting syndrome,PMWS),猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratorydiseasecomplex,PRDC)、猪皮炎肾病综合征等多种猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus-associated disease,PCVAD),导致病畜出现免疫抑制、多系统功能衰竭及繁殖障碍等,严重威胁养猪业健康发展3-4。PCV2基因组包含11个开放阅读框(openreadingframes,ORFs),其中ORF1编码病毒复制蛋白(Rep
13、),O R F2 编码核衣壳蛋白(Cap),Ca p 为PCV2免疫原性蛋白5,根据PCV2基因组特征可将其分为8 种基因型(PCV2aPC V 2 h),其中PCV2d是目前流行的基因型6 在自然条件下,PCV2可通过粪便、尿液排泄物和污染水源等进行水平传播,还能通过精液、胎盘屏障和哺乳等方式进行垂直传播7-8 。野鼠数量庞大,且生存能力强,在养殖场(包括猪场)附近十分常见,其可作为中间宿主或媒介传播多种传染性疾病,如鼠疫和猪伪狂犬病等9。家猪和野猪是PCV2的天然宿主,此外,PCV2还可感染人类10 和其他哺乳动物(如牛、犬、羊和狐狸等)1-13,这利于PCV2的流行与传播。研究表明,小鼠
14、在人工感染PCV2后,可在其肝、肺和淋巴组织中检测到病原原14-15为证实野鼠能作为PCV2的中间宿主和传播媒介,且了解鼠源PCV2基因变异情况,本研究采集湖南省某地区已知流行PCV2猪场妊娠母猪血清样本和猪场周边野鼠组织样本,通过PCR检测样本中PCV2核酸,扩增并测序部分阳性样本PCV2全基因序列,对所得基因序列进行分析比对,绘制系统进化树;最后对鼠源PCV2进行分离与间接免疫荧光鉴定1材料与方法1.1样品和试剂2022年,从湖南省某地区PCV2阳性猪场采集妊娠母猪的血清样本(10 份)以及野鼠样本(2 7份)。DNA提取试剂盒购自北京天恩泽生物技术有限公司。2 XEasyTaqMix、2
15、 XFa s t PFU M i x 和大肠杆菌DH5感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。DL2000DNAMarker购自南京诺唯赞生物科技有限公司。DNA普通纯化试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自美国Omega公司。PK-15细胞和PCV2多克隆抗体由本实验室保存1.2样品病毒DNA的提取参照DNA提取试剂盒说明书提取猪血清、野鼠不同组织样本(心脏、肝、脾、肺和肾)DNA基因组,操作按试剂盒说明书进行1.3引物的设计与合成通过PrimerPremier5.0软件设计PCV2检测引物(PCV2-1F/R)和扩增PCV2全基因组全长引物(PCV2-2F/R),引物由南京金斯瑞生物科技有限公
16、司合成(表1)。表1PCR引物序列与扩增片段长度Table1PCR primers sequences with amplified fragmentlength引物引物序列(5 3)扩增长度/bpPrimerPrimersequencesLengthPCV2-1FTTCGGTACCAGCTATGACGTATCCAAG751PCV2-1RGCCAAGCTTTCACTTCGTAATGGTTTTPCV2-2FCGGGGTACCACTGAGTCTTTTTTATCACTTCG1767PCV2-2RCCCAAGCTTAAGACTCAGTAATTTATTTCATATGG1.4样本PCR检测采用PCR检测样
17、本中是否存在PCV2核酸,PCR检测体系:DNA模板1.0 L,上、下游引物各0.6L,2 Easy Taq Mix10.0L,最后用ddH,O补足2 0.0 L。PCR 反应条件:94预变性5min;9489孟晨光等:野鼠中猪圆环病毒2 型毒株的分离鉴定及其基因变异情况分析第1期变性30 s,60退火30 s72延伸30 s,35个循环;7 2 延伸7 min。反应结束后取部分PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测1.5PCV2全基因组PCR扩增及测序以PCV2阳性样本DNA为模板,采用PCR扩增PCV2基因组全长序列,PCR反应体系:DNA模板1.0 L,上、下游引物各1.0 L,2Fast
18、PFUMix25.0L,最后用ddH,O补足50.0 L。PCR 反应条件:94预变性5min;94变性30 s,60退火30 s,72延伸2 min,35个循环;7 2 延伸7 min。通过凝胶电泳检测方法得到目的条带,并进行纯化,将目的片段与pSP72载体连接,转化至大肠杆菌DH5感受态细胞中扩增,用质粒小量提取试剂盒提取扩增的质粒,通过酶切验证后,送至南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序1.6序列比对与系统进化分析从GenBank数据库下载不同基因型PCV2基因组全长序列,采用DNAStar软件分析本研究中猪源和野鼠源PCV2与参考株基因组核苷酸序列的相似性;基于PCV2基因组全长,使用M
19、EGA5.0软件中Neighbor-Joining法构建遗传进化树(bootstrap值为10 0 0),分析本研究获得PCV2分离株的遗传进化特征;利用DNAMAN软件分析鼠源PCV2株与参考株Cap氨基酸序列特征1.7病毒的分离培养切取PCV2阳性野鼠肾组织样品(1g)置于离心管,加人少量灭菌PBS溶液后高速匀浆,反复冻融3次后离心(12 0 0 0 r/min5min),取上清液,使用0.2 2 m滤膜过滤,加人1%的青霉素-链霉素双抗(4过夜)。取1mL上清液接种于单层(密度约80%)PK-15细胞,置于37 细胞培养箱中孵育2 h;弃去上清,PBS润洗1遍,加人含2%NBCS的DME
20、M培养7 2 h;将细胞反复冻融3次,收集含病毒的上清液,按上述方法盲传5代1.8病毒的间接免疫荧光鉴定将收获的病毒液适量稀释后侵染单层PK-15细胞,置于37 细胞培养箱中,孵育2 h;用PBS润洗1遍,加人含2%NBCS的DMEM培养48 h后进行IFA鉴定。简要流程如下:用PBS润洗细胞1遍;加入4%多聚甲醛固定细胞2 0 min,PBS润洗1遍;加人1%Triton-100孵育15min,PBS润洗1遍;加人3%BSA溶液室温封闭1h,弃去上清;加人鼠源PCV2多克隆抗体(1:2 0 0 0 稀释)孵育1h,PBS润洗3遍;加人山羊抗鼠FITC标记荧光二抗(1:30 0 0 稀释)孵育
21、1h(避光),PBS润洗3次;使用DAPI对细胞核染色,置于荧光显微镜下观察结果。2结果2.1猪和野鼠样本中PCV2的检测与基因组扩增以PCR法检测母猪血清及野鼠组织样本PCV2核酸阳性率,结果显示,37 份样品PCV2核酸阳性率为18.92%(7/37),其中母猪血清和野鼠组织样本阳性率分别为2 0.0%(2/10)和18.52%(5/2 7)。为了确定PCV2在感染野鼠体内的分布,另外选取2只检测结果为阳性的野鼠,取其心脏、肝、脾、肺和肾分别进行PCV2检测,结果显示,野鼠的心脏、肝、脾、肺和肾均可检测到PCV2DNA片段,母猪血清与野鼠不同组织PCR产物与阳性对照条带大小均一致,为7 5
22、1bp(图1)。同时通过PCR扩增后测序得到的猪与野鼠PCV2全基因组序列(HNRCV分离株)大小均为17 6 7 bp,经核苷酸序列比对后,发现同源性为10 0%,鉴定为属于同一毒株,并命名为HNRCV分离株(GenBank登录号:OQ555172)。MNP123 45672.000 bp1 000bp750bp-751 bp500bp250bp100bp图1猪和野鼠样本PCV2的PCR检测结果Figure 1 Swine and wild mice samples of PCV2 PCR de-tection resultsM:DNA分子质量标准;N:空白对照;P:阳性对照;1 5:分别为
23、野鼠的心脏、肝、脾、肺、肾DNA样本;6、7:母猪血清DNA样本。M:DL2000 DNA Marker;N:Negative control;P:Positive control;1-5:The wild mice heart,liver,spleen,lung,kidney DNA samples;6,7:Serum DNA samples from sows.2.2系统进化树的构建与同源性分析将获得的HNRCV分离株与PCV2参考株核苷酸序列构建系统进化树(图2),结果显示,HNRCV分离株与PCV2d分支中的中国毒株SD、T J0 6、PCV-Y1、BD H、中国台湾毒株HL-2、美国
24、毒株2 2 6 2 5-33属于同一分支,将此分支中所有毒株的全基因组和Cap序列进行同源性比对,结果(表2)显示,全基因组同源性最低为97.6 8%,Cap序列同源性最低为97.02%。本次发现的HNRCV分离株被划分为PCV2d,系统进化树显示,该毒株与中国毒株BDH、中国台湾毒株HL-2、美国毒株2 2 6 2 5-33的亲缘关90第54卷中国兽医科学系较近,与美国毒株2 2 6 2 5-33的同源性最高,全长基因组核苷酸序列同源性高达9 9.8 9%,Cap核苷酸序列同源性达9 9.7 2%2.3HNRCV分离株Cap氨基酸序列突变分析选取部分已报道的PCV2分离株的Cap与HNRCV
25、分离株的Cap区域进行氨基酸序列突变分析,结果(图3)显示,HNRCV分离株Cap中的LoopGH的第18 3位氨基酸由亮氨酸(L)突变为异亮71AF055393DQ62911881DQ92352492FJ60854190-AY177626PCV2b100AY322003FJ608547100AY6911699763LHQ202970AF201310AY180396100AY146993100AF166528PCV2a9355AY424403AF38117673AJ223185100AB072301AY181947KC51500199EF52453999HQ202973PCV2dRCV99HM
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