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氧诱导视网膜病变模型小鼠肾组织代谢组学研究.pdf
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1、CD01:10.3760/cma5989-20220526-00248实验研究.19.中华实验眼科杂志2 0 2 4年1月第42 卷第1期Chin JExp Ophthalmol,January2024,Vol.42,No.1氧诱导视网膜病变模型小鼠肾组织代谢组学研究董利军祁慧杨宇航毛星星张国明张少冲雷和田深圳市眼科医院暨南大学附属深圳眼科医院深圳市眼病防治研究所,深圳518 0 40通信作者:雷和田,Email:le ih e t ia n 18 h o t m a il.c o m【摘要】目的探讨高氧环境对氧诱导视网膜病变(OIR)模型小鼠肾脏代谢物的影响,了解病理性视网膜血管新生和肾损伤
2、之间的潜在机制。方法采用随机数字表法将16 只健康SPF级C57/B6J新生小鼠随机分为OIR组与正常对照组,每组8 只。小鼠自出生后标准饲养至第7 天(P7),O I R 组小鼠和母鼠置于(7 52)%的高氧箱中饲养至P12,然后正常饲养;正常对照组一直在正常环境下饲养。各组小鼠在饲养P17时采用二氧化碳安乐死,取视网膜组织铺片并行血管异凝集素(IB4)染色,观察视网膜血管形态、中央无灌注区及病理性新生血管情况;另取小鼠肾组织进行液相色谱-质谱分析,取其对应小鼠的全血进行抗凝处理,通过离心沉淀,获得不含细胞成分的血浆,对血浆进行靶向代谢组学分析。使用代谢组学数据处理软件ProgenesisQ
3、Iv2.3对质谱信息进行解析,用无监督的主成分分析及正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)来区分各组间代谢轮廓的总体差异,比较2 个组间代谢物的倍数变化。以变量权重值 1且P0.05为条件筛选出差异代谢物。基于KEGG数据库对差异代谢物进行代谢通路富集分析。结果视网膜铺片IB4染色结果显示,P17时正常对照组小鼠视网膜血管分布均匀;OIR组小鼠视网膜周边血管迁曲、紊乱,中央可见大面积无灌注区域形成,在视网膜无灌注区和血管区交界处形成大量新生血管簇,呈强荧光染色。OIR组小鼠视网膜无灌注区相对面积为(2 5.16 3.50)%,明显大于正常对照组的(0.6 30.30)%,差异有统计学意义(t=
4、12.0 7,Pl and P value0.05 was used to screen out differential metabolites.Metabolic pathway enrichmentanalysis of differential metabolites was performed based on the KEGG database.The feeding and use of animals werestrictly in accordance with the requirements of the Ethics Committee of Jinan Univers
5、ity,and the research protocol wasreviewed and approved by the Ethics Committee of Jinan University(No.20200401-54).ResultsThe IB4staining of retinal wholemounts showed that the retinal blood vessels were evenly distributed in the P17 mice fromcontrol group.The peripheral retinal vessels were tortuou
6、s and disordered with a large non-perfusion area in centralregion in P17 mice from OIR group,and a large number of neovascularization clusters were formed at the junction ofthe nonperfusion area and the vascular area of the retina,showing strong fluorescent staining.The relative area ofretinal nonpe
7、rfusion area in 01R group was(25.163.50)%,which was significantly larger than(0.630.30)%innormal control group(t=12.07,P1为筛选条件评估2 个组之间有差异的代谢产物及其倍数变化(foldchange,FC)。1.2.6肾组织代谢产物KEGG富集通路分析对筛选得到的差异代谢物利用其KECGID在KECG(h t t p:/w w w.k e g g.j p)数据库进行富集分析,应用超几何检验,找出与整个背景相比,在显著性差异表达代谢物中显著富集的代谢通路,以P0.05为阈值,满
8、足此条件的代谢通路为在差异代谢物中显著富集的代谢通路,P值越小,则该代谢通路的富集越显著。1.3统计学方法采用SPSS22.0统计学软件进行统计分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验证实呈正态分布,以xs表示。OIR组与正常对照组间小鼠视网膜无灌注区相对面积、肾组织代谢产物差异倍数和血浆代谢产物的差异比较均采用独立样本t检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.12个组小鼠视网膜血管分布及无灌注区相对面积比较视网膜铺片IB4染色结果显示,正常对照组P17小鼠视网膜血管均匀分布于整个视网膜,血管走行正常;OIR组小鼠视网膜中央出现大面积的无灌注区,与血管区界限明显,其分界处形成大量新生
9、血管簇,血管走行紊乱(图1)。OIR组视网膜无灌注区相对面积为(2 5.16 3.50)%,明显大于正常对照组的(0.6 30.30)%,差异有统计学意义(t=12.07,P1为筛选标准,共筛选出组间差异代谢物2 36 个,其中表达上调134个,下调10 2 个(图4)。2.32个组小鼠肾组织差异代谢物的鉴定及分层聚类分析对筛选的VIP值 1结合t检验中P0.05的差异代谢产物标准在HMDB、Li p i d m a p s、M ET LIN以及自建库进行比对鉴定,得到2 6 种有意义的化合物(表1)。OIR组小鼠肾组织中甘油磷脂类化合物PC20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0:0和PC
10、22:6(4Z,7Z,10Z,R2=(0.0,0.9)Q2=(0.0,-0.488)1001000050(%8:81)100d5000(%t1)2d00.R2Q2-50-5000-100-10.000-1000100-10000010.0000.000.250.500.751.00PC1(24.1%)APC1(21%)200permutations1componentsC图2 2 个组小鼠肾组织代谢产物分析图A:PC A 表达的代谢产物总体分布图B:OPLS-DA测试的代谢轮廓图C:RPT的反应排序图蓝色矩形和红色三角分别代表正常对照组小鼠肾组织样本和OIR组肾组织小鼠样本Figure 2Me
11、tabolites analysis diagram of mice renal tissues in different groupsA:Overall distribution of metabolites by PCAB:Metabolite profileby OPLS-DA test C:RPT reaction sequence diagram The blue rectangle represented mouse kidney tissue samples from normal control group,while thered triangle represented t
12、he kidney tissue mouse samples from OIR group0.471.0PC14:1197.1/20-2(11Z-147.)PEP-18-0/204(6E.8Z.11Z.14Z)(SOHISI)0.59,tz15.Cktaga1rco.1-o0.2KS13:0V19.0PS18:0V19-0(H100)dPEP-1R-0/30:416E.X2B1Z,14Z)(SOHIS)0.0PC204(5Z8Z211Z.142)10.0L-HiA40PPC14:1(921/202(11Z.14Z)0.0A-Dhydro-2H-I-bPC2054(SZ.8Z,11Z.14ZNO
13、.0-0.5-0.22-HylruirurtscaxidLyoPC00r160L-leyeudineA4-hhydro-2H-3-b-1.0-0.4-0.20.00.2-0.20.00.2PC1(21%)PC1(21%)图32 个组小鼠肾组织代谢产物OPLS-DA模型的载荷图和S-plot图A:载荷图图中每个点代表一种代谢物,代谢物距离载荷图中心的距离越远,载荷值越接近于-1或1,即该代谢产物作用愈大B:S-plot图横坐标是组间比较的代谢产物与影响的特征值,纵坐标是代谢产物得分。代谢产物越靠近右上角和左下角,表示组间差异越显著Figure 3 Loading plot and S-plot
14、of OPLS-DA model of mice renal metabolites in two groups A:Loading plot Each dot represented a metabolite.The farther the metabolite was from the center of the loading plot,the load value was closer to-1 or l,indicating the greater effect of the metabolite wasB:S-plot diagram The horizontal coordina
15、te was the characteristic value of the metabolites and effects being compared between groups,and the verticalcoordinate was the metabolite score.The closer the metabolites were to the upper right and lower left corners,the more significant was the difference betweengroups24:Chin J Exp Ophthalmol,Jan
16、uary 2024,Vol.42,No.1中华实验眼科杂志2 0 2 4年1月第42 卷第1期8VIP611224下调无显著变化2上调P=0.050-6-3036log,(FC)图42 个组小鼠肾组织差异代谢产物火山图圆点越大提示VIP值越大,VIP值1且远离坐标轴原点者为优先考虑的潜在生物标志物VIP:变量权重值;FC:倍数变化Figure 4Volcano plot of differential metabolites in mice renal tissuebetween two groups of miceThe bigger the dot,the bigger the VIPva
17、lue.Dots with a VIP value 1 and far from the origin of the axis werethe potential biomarkers with priorityVIP:variableimportantinprojection;FC:fold change13Z,16Z,19 Z)/0:0 代谢产物表达上调,PC14:1(9Z)/20:2(11Z,14Z)和PEP-18:0/20:4(6E,8Z,11Z,14Z)(50 H S)代谢产物表达下调。氨基酸类代谢物精氨酸、鸟氨酸、哌可酸和羟基赖氨酸代谢产物水平升高。分层聚类分析结果显示,相较于正常
18、对照组,OIR组肾组织中氨基酸类代谢物精氨酸、鸟氨酸、哌可酸、脯氨酸和羟基赖氨酸含量及甘油磷脂类化合物PC14:1(9Z)/20:2(11Z,14Z)、PEP-18:0/20:4(6 E,8 Z,11Z,14Z)(50 H S)含量均明显升高,PC20:4(5Z,8 Z,11Z,14Z)/0:0、PC 2 2:6(4Z,7 Z,10 Z,13Z,16 Z19 Z)/0:0 含量及嘌呤类(鸟嘌呤、羟嘌醇)和脂肪酸类(15-棕榈酸甲酯、2,6,8,12-tetramethyl-2,4-tridecadien-1-ol)含量均降低(图5)。表12 个组小鼠肾组织中主要差异代谢产物比较Table 1
19、Comparison of main differential metabolites in mouse kidney tissue between OIR group and normal control group代谢物分子式VIPLog2(FC)P值PC 14:1(9Z)/20:2(11Z,14Z)C42 H7sNO,P23.10-0.760.0001PEP-18:0/20:4(6E,8Z,11Z,14Z)(50HSJ)C43H7sNO:P21.87-0.92a0.0005L-isoleucineC,H13NO221.590.26b0.000 53,4-dihydro-2H-1-benz
20、opyran-2-oneC,H0220.680.25b0.00042-hydroxycinnamic acidC,H0313.310.16h0.004.4L-histidinolC.H.N,O12.82-0.15a0.000 4PC 20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0:0C2.H5oNO,P11.380.27h0.000 8PC 22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0:0C3oHsoNO,P10.890.38b0.001 7L-pipecolic acidC.H.,NO29.080.28h0.000 3L-histidineC,H,N,O24.960.25b0.00
21、01phosphoglycolic acidC,H,O,P3.910.10b0.000 4oxypurinolC,HAN,O23.890.32b0.0012guanosineCioHi3 N,O,3.49-0.74a0.0002L-ornithineC,H/2 N,023.470.46b0.001 015-methylpalmitateCi7 H 34 022.89-0.14a0.0003N-acetylmannosamineC,His NO.2.630.28h0.00205-hydroxylysineC,Hi4N,032.290.53b0.000 3guanineC,H,N,O2.21-0.
22、70a0.000 12,6,8,12-tetramethyl-2,4-tridecadien-1-olCi7H32 02.12-0.16a0.001 6N-acetyl-D-glucosamineC.H,sNO61.840.37h0.000 3L-arginineC,H.4N4O27.330.28b0.001 1L-glutamineC,HioN,O31.680.75h0.0045hypoxanthineC,H,N4O9.430.13b0.0100L-prolineC,H,NO210.700.22h0.0039adenosine monophosphateCloH,4N,O,P2.05-0.2
23、70.033 8adenosineC1oH/3N,O42.01-0.40a0.0453注:P值表示富集显著性a:下调产物;b:上调产物VIP:变量权重值;FC:倍数变化Note:P value indicated enrichment significance a:down-regulation of expression;b:up-regulation of expressionVIP:variable importance of projection;FC:fold change25.ChinJExpOphthalmollanuary2024,Vol.42,No.1中华实验眼科杂志2 0
24、2 4年1月第42 卷第1期OIR-1OIR-2OIR-3 OIR-4OIR-5OIR-6OIR-7OIR-8WT-1WT-2WT-3WT-WT-5 WT-6WT-WT-8L-prolineL-histidineL-arginine-pipecolicacidL-isoleucine03,4-dihydro-2H-1-benzopyran-2-one-glutamine2-hydroxycinnamicacidPc22:6(4Z,7,10Z,13Z,16Z,19Z)0:0L-ornithine5-hydroxylysineN-acetyimannosamineN-acetyi-D-glucos
25、aminePC20:4(5z,82,11Z,14ZV0:0oxypurinolphosphoglycolicacidhypoxanthineadenosinemonophosphateadenosinePEP-18:0/20:4(6E,8Z.11Zz.14ZX50HS)PC14:1(9Z)/20:2(11Z,14Z)15-Methylpalmitate2.6,8.12-tetramethyi-2,4-tridecadien-1-olL-histidinolguanineguanosine图52 个组小鼠主要差异代谢产物聚类热图垂直轴代表代谢产物,水平轴代表不同样本组。红色表示代谢产物含量最高,
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