外源谷胱甘肽对青花菜硫代葡萄糖苷合成的影响.pdf

中中 国国 瓜瓜 菜菜试验研究2024，37（2）：52-60收稿日期：2023-09-01；修回日期：2023-12-08基金项目：国家重点研发计划（2022YFF1003000）；国家自然科学基金（32372682，32272747，32072585，32072568）；国家重点研发计划国际合作项目金（2022YFE0108300）作者简介：陈芳珍，女，在读硕士研究生，研究方向为蔬菜分子育种。E-mail：通信作者：黄科，男，教授，研究方向为十字花科蔬菜分子育种。E-mail：DOI：10.16861/ki.zggc.202423.0570外源谷胱甘肽对青花菜硫代葡萄糖苷合成的影响陈芳珍，张文霞，唐晨晨，李维欢，武志健，王军伟，吴秋云，黄科（蔬菜生物学湖南省重点实验室 园艺作物种质创新与新品种选育教育部工程研究中心 农业农村部园艺作物基因资源评价利用重点实验室 湖南农业大学园艺学院长沙410128）摘要：为探究谷胱甘肽对硫代葡萄糖苷（GSLs）生物合成的影响，以现蕾期青花菜品种耐寒优秀为试验材料，研究不同浓度的还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）及丁硫堇（BSO）对青花菜花球中硫代葡萄糖苷及其相关底物含量、酶活性和基因表达的影响。结果表明，与 CK（蒸馏水）相比，5 mgL-1GSH 在处理 48 h 显著提高了青花菜花球中总硫苷、脂肪族硫苷含量，在 2448 h 显著提高半胱氨酸（Cys）含量，在 624 h 显著提高了谷胱甘肽含量，在 312 h 显著提高了硫苷合成相关基因的表达量；45 mgL-1GSH 处理在 48 h 显著降低了青花菜花球中总硫苷、脂肪族硫苷含量，在 348 h 则显著提高了半胱氨酸含量，在 648 h 则显著提高了谷胱甘肽含量，在 312 h 显著抑制了硫苷合成相关基因的表达。与 CK 相比，5 mgL-1GSSG 处理下青花菜花球中总硫苷、脂肪族硫苷含量显著升高，而 25、45 及 65 mgL-1GSSG 处理则对总硫苷、脂肪族硫苷含量没有产生显著影响。综上所述，外源谷胱甘肽对硫苷含量的影响具有浓度效应，5 mgL-1GSH 促进硫苷合成，45 mgL-1GSH 抑制硫苷合成。关键词：青花菜；硫代葡萄糖苷；谷胱甘肽（GSH）；酶活性；基因表达中图分类号：S635.9文献标志码：A文章编号：1673-2871（2024）02-052-09Effect of exogenous glutathione on the synthesis of glucosinolates inbroccoliCHEN Fangzhen,ZHANG Wenxia,TANG Chenchen,LI Weihuan,WU Zhijian,WANG Junwei,WUQiuyun,HUANG Ke（Hunan Provincial Key Laboratory of Vegetable Biology/Engineering Research Center for Horticultural Crop Germplasm Innovationand New Variety Selection and Breeding,Ministry of Education/Key Laboratory for Evaluation and Utilization of Horticultural CropGenetic Resources,Ministry of Agriculture and Rural Affairs/College of Horticulture,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,Hunan,China）Abstract:To investigate the effects of glutathione（GSH）on glucosinolate（GSLs）biosynthesis,the effects of differentconcentrations of reduced glutathione（GSH）,oxidized glutathione（glutathione disulfide;GSSG）,and glutathione inhibitor（BSO）were studied on the content of glucosinolate and related substrates,enzyme activity,and gene expression in broccolifloret,using the broccoli variety Naihanyouxiu at the budding stage as experimental material.The results showed that,compared to CK,the 5 mgL-1GSH treatment significantly increased the total GSL and aliphatic GSL content in broccolifloretat48h.Itsignificantlyincreasedcysteine（Cys）contentat24-48h,significantlyincreasedglutathionecontentat6-24h,and significantly increased the expression of genes related to GSLs biosynthesis at 3-12 h.The 45 mgL-1GSH treatmentsignificantly reduced the total GSL and aliphatic GSL content in the broccoli floret at 48 h,while significantly increasingcysteine content at 3-48 h and glutathione content at 6-48 h,and significantly inhibiting the expression of genes related toGSLs biosynthesis at 3-12 h.When compared with CK,the treatment with 5 mgL-1GSSG resulted in a significant increasein the content of total GSL,aliphatic GSLin broccoli floret,while treatments with 25,45,and 65 mgL-1GSSG had no effecton the content of total GSL,aliphatic GSL.In conclusion,exogenous glutathione has a concentration effect on the GSLscontent,with low concentrations promoting GSLs biosynthesis while high concentrations inhibiting GSLs biosynthesis.Key words:Broccoli;Glucosinolate;Glutathione（GSH）;Enzyme activity;Gene expression52第2期，等：葡萄糖苷合成的影响试验研究青花菜（Brassica oleracea L.var.italica Plenck）为十字花科芸薹属甘蓝种蔬菜，含有丰富的膳食纤维、矿物质和植物活性物质硫代葡萄糖苷1，且具有预防癌症的效果，经常食用青花菜可以降低患有多种慢性疾病的风险2-4，因此市场需求逐年增加，在蔬菜周年供应中占有越来越重要的地位。硫 代 葡 萄 糖 苷（简 称 硫 苷，glucosinolates，GSLs），是一类富含氮、硫元素的次生代谢产物，主要存在于十字花科植物中5。到目前为止，已鉴定的硫苷种类约 130 种6，硫苷生物合成前体物质来源于丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，根据前体氨基酸的不同可分为脂肪族硫苷、吲哚族硫苷和芳香族硫苷7-8。植物中硫苷生物合成包括 3个关键步骤：前体氨基酸的侧链延伸、核心结构的构建以及侧链的二次修饰9-10。其核心结构的形成和代谢途径的主要基因都已被鉴定10-11。简而言之，前体氨基酸被 CYP79 家族的细胞色素 P450 转化为醛肟，其中 CYP79B2 催化色氨酸吲哚-3-乙醛肟，CYP79F1 转 化 所 有 长 链 型 甲 硫 氨 酸 衍 生物12-13。接下来，醛肟被 CYP83 家族的细胞色素P450 氧化为活性化合物（氧化腈或酸式硝基化合物），活化的醛肟在多功能酶 GSTs 的作用下与硫供体（Cys 或 GSH）结合生成 s-烷基硫代氢肟酸盐，其中 GSTF11 和 GSTU20 催化脂肪硫苷合成，GSTF9和 GSTF10 催化吲哚硫苷合成14-15，当以 GSH 为硫供体时，硝基化合物与 GSH 的共轭物还要在-谷酰基水解酶（GGP1）的水解作用下才能进入下一步反应。s-烷基硫代氢肟酸盐通过 C-S 裂解酶 SUR1转化为硫代氢肟酸16，其在 UGT74 家族的葡萄糖基转移酶和硫转移酶的作用下形成脱硫葡萄糖苷，其中 UGT74B1 被证明能代谢苯丙氨酸的衍生物，UGT74C1 在脂肪硫苷生物合成中起作用17-18。脱硫硫苷在磺基转移酶 ST 的作用下硫酸化形成完整的硫苷核心结构。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽19，以 GSH（还原型）和 GSSG（氧化型）存在植物体内，其中以 GSH 为主，且只有 GSH 具有生理活性20。GSH 被称为“主要抗氧化剂”，可直接或者间接参与植物活性氧（ROS）清除21。影响谷胱甘肽合成的因素有很多，但最重要的是-谷氨酰半胱氨酸合成酶（-ECS）活性和半胱氨酸（Cys）浓度，-ECS 是 GSH 合成的限速酶（由 GSH1 编码），其活性受到细胞内 GSH 浓度的反馈抑制，当 GSH 浓度过高时，GSH 与-ECS 的调节位点结合，使活性中心变构失活，从而抑制GSH 的合成。谷胱甘肽与 GSLs 合成的关系主要有 2 个方面：一方面是，谷胱甘肽可作为 GSLs 合成的还原性硫供体；另一方面是，谷胱甘肽通过调节初级硫代谢间接影响 GSLs 的合成22-23。已有研究发现，外源 GSH 处理优先激活抗性系统提高植物抗氧化能力，抑制 GSLs 合成24。然而，外源谷胱甘肽对硫苷合成调控机制的研究报道较少。因此，笔者研究的目的是通过测定硫代葡萄糖苷的组分和含量、硫苷合成过程中关键基因的表达量、GSH 的含量和 GSH1、GSH2 的表达，初步分析 GSH 影响青花菜硫苷合成的主要途径。1材料与方法1.1材料供试青花菜品种为耐寒优秀，种子购自高华种子有限公司。试验于 2022 年 12 月至 2023 年 2 月在湖南农业大学蔬菜科研基地进行。选取饱满一致的种子播种于装有育苗基质的 50 穴育苗盘中育苗。待幼苗生长至 4 片真叶时，将植株定植在装有育苗基质的栽培袋中置于塑料大棚内。青花菜植株现蕾后，挑选长势一致无病虫害的植株，进行外源谷胱甘肽处理。本试验设置了 GSH、GSSG、BSO（索莱宝生物科技有限公司）3 个处理，GSH 和 GSSG 设置 4 个处理：5、25、45、65 mgL-1，BSO 设置 1 个处理：25 mgL-1，以蒸馏水作为对照，试验采取随机区组设计。将大棚划分为 10 个小区，将各处理随机排列，每小区种植 18 株，6 株为 1 次重复，每个处理共3 次重复。处理期间于 08：00 开始喷施，以花球均匀布满液滴为准（每小区各喷施 1200 mL），每隔 3 d处理 1 次。共喷施 7 次，最后 1 次处理时，选取无病虫害的花球分时间点于 0、3、6、12、24 h 取样进行基因表达和生理分析，于 48 h 取样进行硫代葡萄糖苷含量分析及其他生理分析。取样时，用小刀从花茎基部将花球割下，再用剪刀将花蕾剪下并用锡箔纸包好后迅速放入液氮冷冻，保存-80 冰箱备用。1.2方法1.2.1硫代葡萄糖苷含量测定硫代葡萄糖苷含量检测参照已报道的方法25-26，并略做修改。称取0.1 g 冷冻干燥样品，加入 4 mL 70%甲醇和 100 LSinigrin（5 mmolL-1，内标）提取 20 min，提取后，加入醋酸钡，8000 rmin-1离心 10 min。收集上清液，沉淀中加入 70%甲醇重新提取，混合提取的上清陈芳珍，等：外源谷胱甘肽对青花菜硫代葡萄糖苷合成的影响53中国瓜菜第37卷试验研究液。将提取液加入 DEAE SephadexA25 层析柱，液体流尽后加入硫酸酯酶，室温反应 16 h 后洗脱获得脱硫硫苷溶液。使用高效液相色谱法检测硫苷含量（b）并计算（以 molg-1表示）。硫苷含量/（molg-1）=。1.2.2半胱氨酸（Cys）含量和-谷氨酰半胱氨酸合成酶（-ECS）活性测定采用索莱宝生物科技有限公司的试剂盒对半胱氨酸（Cys，BC0185）含量、-ECS（BC1215）活性进行测量。1.2.3谷胱甘肽含量测定采用索莱宝生物科技有限公司的试剂盒对谷胱甘肽（GSH，BC1175）含量进行测定27-28。1.2.4RNA 的提取及表达量的分析采用 SteadyPure Plant RNA Extraction Kit 试剂盒（湖南艾科瑞）从青花菜花球中提取总 RNA。以不同处理的青花菜花球 RNA 为模板，按照 TransScript All-in-OneFirst-Strand cDNA SynthesisSuperMix for qPCR 试剂盒（南京诺唯赞）用 1 g 总 RNA 合成 cDNA。将100 ngL-1的 cDNA 样品使用 AceQ qPCR SYBRGreen Master Mix 试剂盒（南京诺唯赞）制备 qPCR 反应溶液。实时荧光定量 PCR 分析根据青花菜目的基因的 cDNA 序列利用国家生物技术信息中心（NCBI）设计扩增基因序列的引物（表 1），引物由擎科生物科技有限公司合成。使用 2CT方法分析表达数据。表 1设计用于 RT-qPCR 分析的基因特异性引物序列Table 1Gene-specific primer sequences designed for RT-qPCR analysis基因名称Gene nameACTINGSTF11GSTU20GGP1UGT74C1GSTF10GSTF9GSH1GSH2上游引物（5-3）Forward primer sequenceGGAGCTGAGAGATTCCGTTGACCAAGTATGCGGACCAAGGCGACTTCGAGTACAGGGACGCGTTCGGAGACGAAGGAGAGACCACTCGTAGTCTCACCGAGCTGTAGTGACGTTGGTGGACGTGGAGGCGACTACTTACCAGGGGAAGCAAAGCATTTCAGCAGTCCTCAGCAGTCAAAT下游引物（5-3）Reverse primer sequenceGAACCACCACTGAGGACGATGCTCTTCCACCAAAGCAACGTTCTTGTGAGGCCACACCTCGGTGACCAAAGCAGATGCCACAGCCATGGTTGAGTGGAGTGTCTGGTCCTTGCGATCTGTGTAAACGGGAGGTGAGCCAACAATTCCCATCTCCTCAGCCAAGATGATCCATTGTACCTCTCG1.3统计分析采用 Microsoft Excel 整理所得数据并绘制表格和柱形图，利用 SPSS 20.0 统计软件对所有数据进行单因素方差分析。2结果与分析2.1外源谷胱甘肽处理对青花菜花球中硫代葡萄糖苷含量的影响采 用 高 效 液 相 色 谱 法 共 检 测 出 10 种 硫苷，其 中 6 种为脂肪族硫苷，4 种为吲哚族硫苷。由图1-A 可以看出，与 CK 相比，5 mgL-1GSH和 5 mg L-1GSSG 处理下总硫苷含量分别显著增加了 17.4%、19.4%。而 45 mgL-1GSH 处理下总硫苷含量与 CK 相比显著降低了 21.6%。其他各处理下总硫苷含量与 CK 相比则没有显著变化。脂肪族硫苷是青花菜中最主要的硫苷种类。由图 1-B 可以看出，与 CK 相比，5 mgL-1GSH和 5 mg L-1GSSG 处理下其含量分别显著提高19.7%、21.5%。而 45 mgL-1GSH 处理使其含量与CK 相比显著降低了 20.6%。在其他各处理下，脂肪族硫苷含量与 CK 相比则无显著变化。吲哚族硫苷是青花菜中含量较低的硫苷种类。由图 1-C 可以看出，GSH 处理下，吲哚族硫苷含量随处理浓度的升高呈先降低后升高的趋势，GSSG 处理下，吲哚族硫苷含量随处理浓度的升高呈先降低后升高的趋势。与对照 CK 相比，25 mg L-1GSH 和45 mgL-1GSH 处理下吲哚族硫苷含量显著降低了17.0%和 33.1%。与对照相比，25、45 和 65 mgL-1GSSG 处理下吲哚硫苷含量分别显著下降 34.84%、13.40%、9.60%。25 mgL-1BSO 处理下其含量则没有显著变化。综上所述，与对照相比，5 mgL-1GSH 处理下青花菜花球中总硫苷含量显著上升，45 mgL-1GSH 处理下总硫苷含量显著降低。与对照相比，5 mgL-1GSSG 处理下，青花菜花球中总硫苷含量和脂肪族硫苷含量显著上升。结果表明，不同类型谷胱甘肽脱硫硫苷峰面积内标量（mol）脱硫硫苷响应因子/内标峰面积试样质量（g）54第2期，等：葡萄糖苷合成的影响试验研究对青花菜花球中硫苷含量的影响基本相同，而不同浓度处理对青花菜花球中硫苷含量的影响不同，显示出谷胱甘肽对青花菜花球硫苷含量的影响具有浓度效应。基于这些结果，选取最佳处理质量浓度5 mgL-1GSH 和 45 mgL-1GSH 的样品进行全参数分析。2.2外源谷胱甘肽处理对青花菜花球中硫代葡萄糖苷合成相关基因表达的影响通过 RT-qPCR 检测了 8 个硫苷合成相关基因的相对表达水平，了解外源谷胱甘肽处理后青花菜花球基因表达规律。由图 2 可知，与对照相比，在5 mgL-1GSH 处理后，青花菜花球中 GSTF11、GS-TU20、GGP1、UGT74C1、GSTF10、GSTF9 的表达均得到了诱导，且除 UGT74C1 在 GSH 处理后 3 h 上调效果最显著外，其他基因在处理后 6 h 上调效果最显著。与对照相比，在 45 mgL-1GSH 处理后GSTF11、GSTU20、GGP1、UGT74C1、GSTF10、GSTF9 的表达被抑制，其中 GSTF11、GSTF10 在GSH 处理后 6 h 和 12 h 抑制效果显著，GSTU20 在GSH 处理后 6 h 抑制效果显著。结果表明，与对照相比，5 mgL-1GSH 处理能够有效诱导硫苷合成基因表达，而 45 mgL-1GSH 处理对硫苷合成基因表达有显著抑制作用。2.3外源谷胱甘肽处理对青花菜花球中谷胱甘肽合成的影响2.3.1外源谷胱甘肽处理对青花菜花球中 GSH1 和GSH2 基因表达的影响分析 5、45 mgL-1GSH 外源喷施处理下青花菜谷胱甘肽合成关键基因 GSH1和 GSH2 在 24 h 内的表达情况。由图 3-A 可以看出，与对照相比，GSH1 的表达量在 5 mg L-1和45 mgL-1GSH 处理后的 3 h 和 6 h 显著下调。与CK 相比，处理后 3 h 分别下调了 51%和 39%，处理bcdabcdedeacdebdebc0510152025CK5254565525456525b（总硫代葡萄糖苷）Total thioglucoside content/(mol.g-1)（GSH、GSSG、BSO）/（mg.L-1）处理 Treatment aabbcababcbbab00.30.60.91.21.51.8CK5254565525456525b（总吲哚族硫苷）Tsotal indole thioside/（mol.g-1）（GSH、GSSG、BSO）/（mg.L-1）处理 Treatment CK5254565525456525bcabcdcdabcdbcdb0510152025CK5254565525456525b（总脂肪族硫苷）Total aliphatic thiosides/（mol g-1）（GSH、GSSG、BSO）/（mg L-1）处理Treatment 注：不同小写字母表示处理间在 0.05 水平上差异显著。Note:Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at 0.05 level.图 1外源还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）及谷胱甘肽抑制剂（BSO）处理对青花菜中硫代葡萄糖苷含量的影响Fig.1Effects of exogenous glutathione（GSH）,glutathione disulfide（GSSG）,and glutathione inhibitor（BSO）treatmentson the content of glucosinolates in broccoli/（molg-1）CK452525GSHGSSGBSOCK452525GSHGSSGBSOCK452525GSHGSSGBSOab/（mgL-1）/（mgL-1）/（mgL-1）处理 Treatment处理 Treatment陈芳珍，等：外源谷胱甘肽对青花菜硫代葡萄糖苷合成的影响Total indole thioside content/（molg-1）b（总吲哚族硫苷）Total aliphatic thioside content/（molg-1）ABC55中国瓜菜第37卷试验研究baaaaabbaabbbaa0.00.51.01.52.00361224相对表达量Relative expression levels谷胱甘肽处理时间/hGlutathione treatment time/hGSH1CK 5 mg.L-1 GSH 45 mg.L-1 GSHaaaaaaaaaaaaaaa0.00.51.01.52.00361224相对表达量Relative expression levels谷胱甘肽处理时间/hGlutathione treatment time/hGSH2 CK 5 mg.L-1 GSH 45 mg.L-1 GSHabbaaaaaaaabcba02460361224相对表达量Relative expression levels 谷胱甘肽处理时间/hGlutathione treatment time/hGSTF11CK 5 mg.L-1 GSH 45 mg.L-1 GSHabbbaaaaaabbcba0.00.51.01.52.00361224相对表达量Relative expression levels谷胱甘肽处理时间/hGlutathione treatment time/hGSTU20 CK 5 mg.L-1 GSH 45 mg.L-1 GSHabbbaaaaaaabbca0123450361224相对表达量Relative expression levels谷胱甘肽处理时间/hGlutathione treatment time/hGGP1CK 5 mg.L-1 GSH 45 mg.L-1 GSHbbaaabbaaaaacabb02460361224相对表达量Relative expression levels谷胱甘肽处理时间/hGlutathione treatment time/hUGT74C1 CK 5 mg.L-1 GSH 45 mg.L-1 GSHbbbbabaaaaabbccb01230361224相对表达量Relative expression levels谷胱甘肽处理时间/hGlutathione treatment time/h GSTF10CK 5 mg.L-1 GSH 45 mg.L-1 GSHaabbaaaaaaaabbb0246810120361224相对表达量Relative expression levels谷胱甘肽处理时间/hGlutathione treatment time/h GSTF9CK 5 mg.L-1 GSH 45 mg.L-1 GSH注：相同时间处理的不同小写字母表示在 0.05 水平上差异显著。下同。Note：Different lowercase letters for the same time treatment indicate significant differences at 0.05 level.The same below.图 2不同浓度外源 GSH 处理对青花菜硫代葡萄糖苷合成相关基因表达量的影响Fig.2The influence of exogenous GSH treatment at different concentrations on the expression levels of genes related toglucosinolate synthesis in broccoli图 3不同浓度外源 GSH 处理对青花菜谷胱甘肽合成相关基因表达量的影响Fig.3The effects of different concentrations of exogenous GSH treatment on the expression levels of genes related toglutathione synthesis in broccoliACEBDFAB5 mgL-1GSH45 mgL-1GSH5 mgL-1GSH45 mgL-1GSH45 mgL-1GSH5 mgL-1GSH45 mgL-1GSH5 mgL-1GSH5 mgL-1GSH45 mgL-1GSH45 mgL-1GSH5 mgL-1GSH相对表达量Relative expression levels45 mgL-1GSH5 mgL-1GSH5 mgL-1GSH45 mgL-1GSH处理时间处理时间处理时间处理时间处理时间处理时间处理时间处理时间Treatment time/hTreatment time/hTreatment time/hTreatment time/hTreatment time/hTreatment time/hTreatment time/hTreatment time/h56第2期，等：葡萄糖苷合成的影响试验研究aacccbaabbbbaaaaaa0100200300400500600036122448w（GSH）/（g.g-1）w（GSH content）/（g.g-1）谷胱甘肽处理时间/hGlutathione treatment time/hCK 5 mg.L-1 GSH 45 mg.L-1 GSHabbbbcaabababaaaaaa01020304050036122448w（Cys）/（mo.g-1）w（Cys content）/（mo.g-1）谷胱甘肽处理时间/hGlutathione treatment time/hCK 5 mg.L-1 GSH 45 mg.L-1 GSHaaaaaaaaaaaaaaaaaa0510152025036122448-ECS 酶活性/（mo.g-1）-ECS Enzyme activity/（mo.g-1）谷胱甘肽处理时间/hGlutathione treatment time/hCK 5 mg.L-1 GSH 45 mg.L-1 GSH后 6 h 分别下调了 37%和 62%。但 5 mg L-1和45 mgL-1GSH 处理间 GSH1 的表达量在处理后没有显著差异。与 CK 相比，5 mgL-1和 45 mgL-1GSH 处理下，GSH2 的表达量没有显著变化。结果表明，外源喷施 GSH 处理对 GSH1 和 GSH2 表达没有显著影响。2.3.2外源谷胱甘肽处理对青花菜花球中 Cys 含量和-ECS 活性的影响Cys 是合成植物体内谷胱甘肽的底物，-ECS 是植物体内谷胱甘肽合成途径中的关键酶。通过 GSH 对-ECS 活性的反馈抑制，调控 GSH 的生物合成量。由图 4-A 可以看出，与 CK 相比，5 mgL-1GSH 处理下 Cys 含量在 24 h和 48 h 分别显著提高了 47%和 36%；45 mgL-1GSH 处理下 Cys 含量在 3 h 至 48 h 内都显著积累，且在 24 h 和 48 h 积累效果最明显，与 CK 相比提高了 48%和 51%。由图 4-B 可以看出，不同浓度的图 4不同浓度外源 GSH 处理对青花菜半胱氨酸（Cys）含量和-谷氨酰半胱氨酸合成酶（-ECS）活性的影响Fig.4The influence of exogenous GSH treatment at different concentrations on the content of Cysteine（Cys）and theactivity of-glutamylcysteine synthetase（-ECS）in broccoliABGSH 处理下-ECS 活性无显著变化。由此可知，外源喷施 GSH 显著提高了青花菜花球中 Cys 含量，但是对-ECS 活性则无显著影响。2.3.3外源谷胱甘肽处理对青花菜花球中 GSH 含量的影响由图 5 可知，5 mgL-1GSH 处理后的 6、12、24 h 青花菜花球中 GSH 含量均显著高于 CK，而处理后 48 h 后 GSH 含量与 CK 相比没有显著差异。GSH 含量在 45 mgL-1GSH 处理 648 h 内均显著高于 CK，较 CK 相比分别提高了 1.28、0.77、1.11 和 0.54 倍。结果表明，外源喷施 5 mgL-1GSH在 624 h 内显著增加了青花菜花球中谷胱甘肽含量，外源喷施 45 mgL-1GSH 在 648 h 内显著增加了其含量。3讨论与结论硫代葡萄糖苷是十字花科植物富含硫的次生代谢物，在植物防御和人体营养中具有重要的生物学和经济作用。谷胱甘肽与代谢物结合形成新的代谢物，参与植物的代谢调节。许多研究表明，谷胱甘肽作为还原性硫供体和活化醛肟偶联参与GSLs 生物合成。在非十字花科植物本氏烟草中发现 GSLs 部分的形成涉及 GSLs 偶联中间体，该化合物由-谷氨酰基肽酶（GGP1）代谢，通过代谢积图 5不同浓度外源 GSH 处理对青花菜中谷胱甘肽（GSH）含量的影响Fig.5Effcet of exogenous GSH at different concentrationson the content of glutathione（GSH）in broccoli5 mgL-1GSH45 mgL-1GSH45 mgL-1GSH5 mgL-1GSHb（Cys）Cys content/（molg-1）-ECS 酶活性-ECS activity/（Ug-1）w（GSH）GSH content/（gg-1）处理时间Treatment time/h处理时间Treatment time/h陈芳珍，等：外源谷胱甘肽对青花菜硫代葡萄糖苷合成的影响5 mgL-1GSH45 mgL-1GSH处理时间Treatment time/h57中国瓜菜第37卷试验研究累的谷胱甘肽偶联物显著促进硫代葡萄糖苷的产生29。对突变体 pad2 和 cad 2-1 的分析中，两种突变体都比野生型植物含有更少的 GSH 和更多的Cys，尽管硫苷含量不变，但这两个突变体在昆虫诱导下，吲哚型硫苷的含量下降30。在笔者的试验中，通过 GSH 及 GSSG 处理，确定外源施用低浓度GSH 和 GSSG 对 GSLs 生物合成具有积累效应，施用高浓度 GSH 对 GSLs 生物合成具有抑制作用，施用高浓度 GSSG 使 GSLs 含量略有下降，证实 GSH参与 GSLs 的合成且依赖于相应的浓度。这可能是因为低浓度 GSH 使 GSLs 合成相关基因的表达上调导致 GSLs 含量显著积累，高浓度 GSH 使 GSLs合成相关基因的表达下调导致 GSLs 含量显著下降。对 GSH 处理的拟南芥的分子分析中发现，与色氨酸和 GLS 生物合成途径相关的基因被谷胱甘肽显著上调，因此推断 GSH 诱导 GSLs 的生物合成31，这与笔者的试验结果相似。低浓度 GSH 使 GSLs 合成相关基因的表达上调导致 GSLs 含量显著积累，高浓度 GSH 使 GSLs合成相关基因的表达下调导致 GSLs 含量显著下降。这可能是由于青花菜花球吸收了外源施用的GSH，并将其转运到细胞室中导致细胞内 GSH 及Cys 含量升高，调节了 GSLs 合成相关基因表达从而介导了 GSLs 的生物合成。植物很容易吸收外源施加的谷胱甘肽，并将其转运到细胞室中，诱导一系列生理和生化过程，包括调节基因表达、细胞分裂、生殖生长发育和蛋白质活性32。Cys 既是 GSH的降解产物，也是代谢前体，作为 GSH 合成的前体，可以进一步转化为 Met 用于脂肪族 GSLs 的生物合成33-34。GSH 运输到需要还原硫的器官后，部分 GSH 被降解为 Cys，以进一步结合到其他分子中，如蛋白质和辅酶32。Cys 的吸收量明显高于GSH 的吸收量，这种吸收速率的差异导致抑制硫酸盐摄取和转运所需的 Cys 浓度比引起同样抑制的GSH 浓度低一个数量级35。随着细胞内 GSH 浓度升高及降解 Cys 含量开始积累，高浓度的 Cys 可能抑制了硫酸盐摄取和转运，GSLs 合成基因的下调导致 GSLs 含量的下降。王丹36研究报道，缺硫胁迫下小白菜叶片中的硫苷合成相关基因通过25 mgL-1GSH 进行叶面喷施而先上调后下调导致总硫苷含量下降同时显著增加了 GSH 和 Cys 含量，25 mgL-1GSSG 处理虽然使大部分硫苷合成基因上调，但显著降低了总硫苷含量，增加了 GSH 及Cys 含量；Sinha 等31报道，胁迫状态下外源 GSH 处理可以诱导硫苷合成关键基因的表达以及硫苷含量的上升；何超超37报道，25 mgL-1GSH 处理使小白菜叶片脂肪族和吲哚族合成相关基因表达下调，但对脂肪族和吲哚族硫苷含量没有影响，而 GSH、Cys 含量积累 GSH1 及初生硫代谢关键基因表达水平下降。25 mgL-1GSSG 处理使小白菜叶片脂肪族和吲哚族合成相关基因表达上调，硫苷含量上升，Cys 含量短暂上升而后下降，初生硫代谢关键基因表达上调。这与本试验结果相似，但本研究中GSH 合成关键基因 GSH1 及 GSH2 表达水平不受GSH 处理影响。这可能是由于 GSH1 和 GSH2 由茉莉酸和重金属诱导33，38，对光和某些应激条件（如干旱和某些病原体）也有反应。但到目前为止，相对较差的条件被证明能显著诱导 GSH1 或 GSH2 转录。无论是外部施加的 H2O2还是细胞内产生的H2O2，都不会导致拟南芥中 GSH1 或 GSH2 转录水平的升高，尽管在这些条件下谷胱甘肽的含量得到了显著提升33，39。在本试验中，外源喷施不同浓度的 GSH 后，GSH1 和 GSH2 表达量没有发生变化，-ECS 酶活性同样没有变化。说明外源喷施 GSH对 GSH 生物合成没有产生影响。与对照相比，5 mgL-1GSH