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铁皮石斛多糖通过上皮-间质转化抗肝纤维化.pdf
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1、第 45卷 第1期2024 年 1月Vol.45 No.1January 2024中山大学学报(医学科学版)JOURNAL OF SUN YATSEN UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)铁皮石斛多糖通过上皮-间质转化抗肝纤维化杨柳青1,范钦1,白雅洁1,许颖2,罗继娜2,成家茂1,陈海燕2,3(1.大理大学基础医学院,云南大理,671003;2.大理大学临床医学院,云南大理,671003;3.大理大学第一附属医院超声科,云南大理,671013)摘要:【目的】探讨铁皮石斛多糖(DOP)对CCl4 诱导肝纤维化(HF)的影响及其作用机制。【方法】将56 只雄性SD 大鼠随机分
2、为七组:正常组(NG)、模型组(MG)、秋水仙碱组(CG,0.1mg/kg)、扶正化瘀组(FG,0.45g/kg)、低剂量DOP 组(LDG,0.05 g/kg)、中剂量DOP 组(MDG,0.1 g/kg)和高剂量DOP 组(HDG,0.2 g/kg),每组8 只。采用皮下注射40%CCl4 橄榄油混合液制备HF 大鼠模型,每3 d 注射1次,共10周。造模第6周结束后,各药物组分别给予秋水仙碱、扶正化瘀和DOP 溶液灌胃处理,NG 和MG 大鼠给予等量0.9%生理盐水处理,每天1次,连续4周。各组大鼠肝组织病理学采用苏木精-伊红(HE)、Masson 染色、天狼星红(Sirius red)
3、染色检测;肝功能和肝纤四项指标采用血液生化法检测;肝组织中-SMA、Col-I、E-cadherin、ZEB1 基因和蛋白的表达分别采用RT-qPCR 法和Western Blot 法检测。【结果】HE、Masson、Sirius red 染色结果显示MG 大鼠肝脏组织出现典型的HF 病理特征,LDG、MDG 和HDG 大鼠HF 均出现不同程度改善。肝功能检测结果显示,LDG、MDG、HDG 大鼠的血清AST、TBIL、AKP 水平与MG 相比均显著降低(P 0.05或 0.01),血清ALT 水平除LDG 外均显著降低(P 0.05或 0.01)。肝纤四项指标检测结果显示,LDG、MDG、H
4、DG 大鼠的血清HA、LN、PC-、COL-含量与MG 比较均明显下降(P 0.05或 0.01)。基因、蛋白检测结果显示,LDG、MDG、HDG 大鼠肝组织中-SMA、COL-I、ZEB1 的相对表达量明显降低(P 0.05或 0.01),而E-cadherin 的相对表达量升高(P 0.05或 0.01)。此外,HA、-SMA、COL-I、ZEB1、E-cadherin 的表达均存在一定的DOP 剂量依赖性。【结论】DOP 可通过抑制大鼠肝组织的上皮-间质转化减轻CCl4 诱导的HF 程度。关键词:肝纤维化;铁皮石斛多糖;上皮-间质转化;E-钙黏蛋白;锌指E盒结合同源框1中图分类号:R28
5、5.5 文献标志码:A 文章编号:1672-3554(2024)01-0076-09DOI:10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).20240004.011Dendrobium Officinale Polysaccharide Alleviates Hepatic Fibrosis via Epithelial-Mesenchymal TransitionYANG Liuqing1,FAN Qin1,BAI Yajie1,XU Ying2,LUO Jina2,CHENG Jiamao1,CHEN Haiyan2,3(1.School of Basic
6、Medicine,Dali University,Dali 671003,China;2.School of Clinical Medicine,Dali University,Dali 671003,China;3.Department of Ultrasound Medicine,The First Affiliated Hospital of Dali University,Dali 671013,China)Correspondence to:CHENG Jiamao;E-mail:Abstract:【Objective】To investigate the effect of Den
7、drobium officinale polysaccharide(DOP)on CCl4-induced hepatic fibrosis(HF)and its mechanism.【Methods】A total of 56 male SD rats were randomly divided into seven groups:normal group(NG),model group(MG),colchicine group(CG,0.1 mg/kg),Fuzheng Huayu group(FG,0.45 g/kg),low-dose DOP group(LDG,0.05 g/kg),
8、middle-dose DOP group(MDG,0.1 g/kg)and high-dose DOP group(HDG,0.2 g/kg),with 基础研究 收稿日期:2023-09-25 录用日期:2023-12-01基金项目:2021年云南省地方本科高校基础研究联合专项资金(202101BA070001-101);2023年度云南省教育厅科学研究基金(2023Y0962)作者简介:杨柳青,第一作者,研究方向:中医药抗肝纤维化作用及其机制,E-mail:;成家茂,通信作者,教授,研究方向:中医药抗肝纤维化作用及其机制,E-mail:第1期杨柳青,等.铁皮石斛多糖通过上皮-间质转化抗肝
9、纤维化8 rats in each group.HF rat model was established by subcutaneous injection with 40%CCl4 olive oil mixture,every 3-day for 10 weeks.At the end of the sixth week,the drug groups were treated with colchicine,Fuzheng Huayu and DOP solution by gavage respectively,once a day for 4 weeks.NG and MG grou
10、ps were similarly handled with an equal amount of 0.9%normal saline.Liver histopathology was detected using hematoxylin-eosin(HE),Masson and Sirius red staining;blood biochemistry was tested for liver function and four indicators of HF;RT-qPCR and Western Blot were used to measure the expression of-
11、SMA,Col-I,E-cadherin,and ZEB1 genes and proteins in the liver tissues of rats,respectively.【Results】HE,Masson,and Sirius red staining showed that the liver tissue of MG rats had typical pathologic features of HF,and the degree of HF was alleviated in LDG,MDG,and HDG rats,respectively.Liver function
12、test results showed that the serum AST,TBIL,and AKP levels were significantly lower in LDG,MDG,and HDG,compared with those of the MG(P 0.05 or 0.01).Meanwhile,ALT levels in serum deceased remarkably except in LDG(P 0.05 or 0.01).The four results of HF showed that the serum HA,LN,PC-,and COL-levels i
13、n LDG,MDG,and HDG rats were significantly decreased compared with those of the MG(P 0.05 or 0.01).The relative expressions of-SMA,COL-I,and ZEB1 genes and proteins were significantly decreased in the liver tissues of LDG,MDG,and HDG(P 0.05 or 0.01),and the relative expression of E-cadherin gene and
14、protein increased(P 0.05 or 0.01).In addition,the expressions of HA,-SMA,COL-I,ZEB1 and E-cadherin were dependent on the dose of DOP.【Conclusion】DOP alleviated the degree of CCl4 induced HF in rats by inhibiting the epithelial-mesenchymal transition in liver tissue.Key words:hepatic fibrosis;dendrob
15、ium officinale polysaccharide;epithelial-mesenchymal transition;E-cadherin;Zinc finger E-box binding homeobox 1J SUN Yatsen Univ(Med Sci),2024,45(1):76-84肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是慢性肝病发展为肝硬化、肝癌、肝功能衰竭等终末期肝病的共同病理生理过程,以肝内弥漫性的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)进行性积累为主要特征,具有可逆性。HF 过程中肝星状细胞(hepatic stellate c
16、ell,HSC)被活化,产生大量的I 型胶原蛋白(collagen type I,Col-I)等 ECM 成分,并表达高水平的-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,-SMA)1。研究认为,上皮细胞经历上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是一个可逆的过程,在纤维化和癌症发展中发挥着至关重要的作用,参与了HSC的激活2,可增加肌成纤维母细胞和成纤维细胞的数量,从而驱动多器官纤维化的发生3。目前尚无明确可用于抗HF 的特效药物,但中医药具有多渠道、多层次、多靶点的综合药理作用,在治疗HF 方面具有独特优势4。铁皮
17、石斛对癌症、消化系统疾病和免疫性疾病等具有良好功效5。本课题组前期研究发现6,滇产铁皮石斛及其主要药效成分多糖(dendrobium officinale polysaccharide,DOP)可 通 过 TGF-、Hh、Wnt/-catenin 信号通路发挥抗HF 作用。其中,TGF-/Smad是纤维化的主要途径,其特征为胶原沉积和EMT,并伴有过量的氧自由基7。但 DOP 对 EMT 介导的抗HF 潜在机制仍不清楚。本实验主要探讨EMT 在DOP 抗HF 作用中的机制,为防治HF 提供新思路和新方法。1 材料与方法1.1材 料1.1.1实验动物随机选择8周龄无特定病原体(specific
18、pathogen free,SPF)级雄性SD 大鼠 56 只,体质量(150 20)g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,许可证编号 SCXK(湘)2019-0004,饲养于大理大学动物实验中心,使用普通饲料和纯净水自由饮食饮水,光照 12 h/黑暗 12 h,温度 18 22,适应性饲养1周后开始实验。本实验所有操作均符合大理大学实验动物伦理要求。1.1.2主要药物DOP 粉剂购自于宁夏香草生物技术有限公司(生产批号:XC221015),秋水仙碱片购 自 云 南 植 物 药 业 有 限 公 司(生 产 批 号:20221101),扶正化瘀胶囊购自上海黄海制药有限责任公司(生产批号:21
19、1138)。1.1.3主要试剂分析纯CCl4购自于西陇科学股份有限公司;天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine 77第45卷中山大学学报(医学科学版)transaminase,ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)购自于南京建成生物工程研究所;层黏连蛋白(laminin,LN)、透明质酸(hyaluronic acid,HA)、型前胶原(PC-)、型胶原(Col-)酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒购自于上海酶联生物科技有限公司;苏木精-伊红(HE)、Masson、天狼星红(Si
20、rius red)染色试剂盒购自于北京索莱宝科技有限公司;总RNA 提取试剂盒购自于天根生化科技(北京)有限公司;2 Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix,RIPA 裂解液、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)兔一抗、HRP 标记的山羊抗兔IgG,购自于武汉赛维尔生物科技有限公司;E-钙黏蛋白(E-cadherin)、锌指 E 盒结合同源框 1(zinc finger E-box binding homeobox 1,ZEB1)、-平滑肌肌动蛋白(-SMA)、I型胶原蛋白(Col-I)抗体购自于武汉三鹰生物技术有限公司。1.2方 法1.2.1造模及
21、分组采用随机数字法将56 只大鼠分为正常组(normal group,NG)、模型组(model group,MG)、秋水仙碱组(colchicine group,CG;0.1 mg/kg)、扶 正 化 瘀 组(Fuzheng Huayu group,FG;0.45 g/kg)、DOP 低、中、高剂量组(low-dose DOP group,LDG;middle-dose DOP group,MDG;high-dose DOP group,HDG;分 别 给 予 DOP 0.05 g/kg、0.1 g/kg、0.2 g/kg)8。参考 中华人民共和国药典(2020版),按成人每天6 g(每天6
22、12 g)的用量计算铁皮石斛的大鼠临床等效用量,并根据铁皮石斛的提取率和含多糖质量分数,换算为大鼠的DOP 用量,并设置剂量梯度观察其对相关指标的影响。MG 组和药物组均皮下注射40%CCl4 橄榄油混合液,首次 5 mL/kg 体质量(body weight,BW),之后每次 3 mL/kgBW,每 3 d 注射 1 次,共10 周。NG 组给予等量的橄榄油溶液。1.2.2药物干预将秋水仙碱片磨成细粉,将扶正化瘀胶囊倒出药粉。将DOP、秋水仙碱和扶正化瘀药粉分别溶于0.9%生理盐水(NS)配成相应药液。造模第6 周后,各组大鼠开始给予连续灌胃(DOP、扶正化瘀每只10 mL/kg,秋水仙碱每
23、只0.5 mL/kg),每天 1 次,连续 4 周。NG、MG 组分别给予 0.9%NS 10 mL/kg 只进行对照处理。1.2.3肝脏取材各组大鼠末次灌胃后,禁食12 h,2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。在无菌条件下开腹行腹主动脉取血 5 10 mL,室温静置40 min,1 006.2 g 离心15 min,置于冰箱内4 下保存备检。采血完毕,用50 mL 0.9%NS 自门静脉快速冲洗肝中血液,剪取肝叶,洗净肝表面并去除被覆的肝包膜和周围残留组织后,滤纸吸干。取肝中叶和外叶置于福尔马林溶液中常温固定48 h以上;取剩余肝叶置于-80冰箱中保存备检。1.2.4肝组织病理学检测取肝叶切块约 1
24、 cm1 cm1.5 cm 大小,脱水,石蜡包埋,以5 m 厚度连续切片,常规脱蜡复水后进行HE、Masson 和Sirius red 染色。用Image J 软件计算肝组织的胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF),CVF-Masson、CVF-Sirius red 分别为呈胶原阳性的蓝色面积或红色面积与组织总面积的百分比。1.2.5肝功能指标检测取大鼠腹主动脉血,按检测试剂盒操作步骤,测定ALT、AST、AKP 含量,并采用爱德士兽医专用全自动生化仪检测总胆红素(total bilirubin,TBil)。1.2.6肝纤四项指标检测按照ELISA 说明书,将
25、大鼠血清以样品稀释液稀释5倍,分别设置标准品孔、空白孔、各组样品孔,每孔设置 3 个复孔。在=450 nm 下依序测量每孔的吸光度,计算 HA、LN、PC-、Col-的血清相对含量。计算算式:CHA=(A测定孔-A空白孔)232.69-26.1954 5,R2=0.9972;CLN=(A测定孔-A空白孔)268.4-40.577 5,R2=0.997;CPC-III=(A测定孔-A空白孔)33.561+0.0953 5,R2=0.9917;CCol-=(A测定孔-A空白孔)60.606-5.7555 5,R2=0.9985。1.2.7基因检测应用总RNA提取试剂盒提取肝组织的总 RNA,应用实
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