结核分枝杆菌膜囊泡RNA表达谱分析及功能研究.pdf
《结核分枝杆菌膜囊泡RNA表达谱分析及功能研究.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《结核分枝杆菌膜囊泡RNA表达谱分析及功能研究.pdf(7页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、重点号专题D O I:1 0.1 2 0 3 7/Y X Q Y.2 0 2 4.0 3-0 6牜结核分枝杆菌膜囊泡R NA表达谱分析及功能研究吕翎娜1,刘秋月2(1.首都医科大学附属北京佑安医院 肝病消化中心 首医基础-临床联合实验室,北京 1 0 0 0 6 9;2.首都医科大学附属北京胸科医院 重症医学科 北京市耐药结核病研究重点实验室,北京 1 0 1 1 4 9)【摘要】目的 描绘结核分枝杆菌膜囊泡(m y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s m e m b r a n e v e s i c l e s,MV s)的R NA特
2、征表达谱,分析其主要的生物功能,初步探索其诱导巨噬细胞凋亡的作用。方法 分离结核分枝杆菌MV s,提取总R NA,采用i l l u-m i n a H i s e q 2 5 0 0-S E 5 0平台进行双端测序。使用BWA 软件进行序列比对,通过C OG数据库对基因进行功能注释。通过MT T试验检测细胞存活率,采用A n n e x i n-V联合P I染色法检测细胞凋亡。结果 本研究通过R NA测序及生物信息学分析描绘了结核分枝杆菌MV s中R NA的种类及含量,C OG数据库功能注释结果显示这些R NA主要富集的生物学功能包括脂质转运代谢、氨基酸转运代谢、能量产生与转化、次级代谢物合
3、成转运与代谢和转录等。生物分析显示富集的主要功能包括脂质转运代谢、氨基酸转运代谢、能量产生与转化、次级代谢物合成转运与代谢和转录等。功能实验表明,结核分枝杆菌MV s可以降低TH P-1源巨噬细胞的存活率,促进细胞凋亡。结论 结核分枝杆菌MV s中含有丰富的短片段R NA,具有诱发细胞凋亡的作用。然而其具体作用机制仍需要更深入细致的研究。【关键词】结核分枝杆菌;膜囊泡;核糖核酸测序;细胞凋亡R N A p r o f i l i n g a n d f u n c t i o n a l s t u d y o f m y c o b a c t e r i u m t u b e r c u
4、 l o s i s m e m b r a n e v e s i c l e sL y u L i n g n a1,L i u Q i u y u e2(1.D e p a r t m e n t o f G a s t r o e n t e r o l o g y a n d H e p a t o l o g y,B e i j i n g Y o u a n H o s p i t a l,C a p i t a l M e d i c a l U n i v e r s i t y,B e i j i n g 1 0 0 0 6 9,C h i n a;2.D e p a r
5、t m e n t o f I n t e n s i v e C a r e U n i t,B e i j i n g K e y L a b o r a t o r y f o r D r u g R e s i s t a n t T u b e r c u l o s i s R e s e a r c h,B e i j i n g C h e s t H o s p i t a l,C a p i t a l M e d i c a l U n i v e r s i t y,B e i j i n g 1 0 1 1 4 9,C h i n a)C o r r e s p o
6、n d i n g a u t h o r:L i u Q i u y u e,E-m a i l:l i u q i u y u e b j x k y y.c n【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T h i s s t u d y a i m s t o d e p i c t t h e c h a r a c t e r i s t i c R NA e x p r e s s i o n p r o f i l e o f m y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s m e m b r a n
7、 e v e s i c l e s(MV s),a n a l y s e t h e i r m a i n b i o l o g i c a l f u n c t i o n s,a n d p r e l i m i n a r i l y e x p l o r e t h e i r r o l e i n i n d u c i n g a p o p t o s i s o f m a c r o p h a g e s.M e t h o d s MV s o f m y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s w e
8、r e i s o l a t e d,t o t a l R NA w a s e x t r a c t e d,a n d d o u b l e-e n d s e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d u s i n g t h e i l l u m i n a H i s e q 2 5 0 0-S E 5 0 p l a t f o r m.S e q u e n c e c o m p a r i s o n w a s p e r f o r m e d u s i n g BWA s o f t w a r e,a n d t h
9、 e g e n e s w e r e f u n c t i o n a l l y a n n o t a t e d b y C OG d a t a b a s e.C e l l v i a b i l i t y w a s d e t e c t e d b y MT T a s s a y a n d a p o p t o s i s w a s d e t e c t e d b y A n n e x i n-V c o m b i n e d w i t h P I s t a i n i n g.R e s u l t s T h e p r e s e n t s
10、 t u d y d e p i c t e d t h e t y p e s a n d c o n t e n t o f R NA s i n m y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s MV s b y R NA s e q u e n c i n g a n d b i o i n f o r m a t i c a n a l y s i s.T h e f u n c t i o n a l a n n o t a t i o n t h r o u g h C OG d a t a b a s e s h o w e d
11、 t h a t t h e m a j o r f u n c t i o n s o f t h o s e R NA s e n r i c h e d w e r e i n c l u d i n g l i p i d t r a n s p o r t m e t a b o l i s m,a m i n o a c i d t r a n s p o r t m e t a b o l i s m,e n e r g y p r o d u c t i o n a n d c o n v e r s i o n,s e c o n d a r y m e t a b o l
12、i t e s y n t h e s i s t r a n s p o r t a n d m e t a b o l i s m,a n d t r a n s c r i p t i o n.B i o i n f o r m a t i c a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e m a j o r f u n c t i o n s e n r i c h e d i n c l u d e d l i p i d t r a n s p o r t m e t a b o l i s m,a m i n o a c i d t r a
13、n s p o r t m e t a b o l i s m,e n e r g y p r o d u c t i o n a n d c o n v e r s i o n,s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s y n t h e s i s t r a n s p o r t a n d m e t a b o l i s m,a n d t r a n s c r i p t i o n.F u n c t i o n a l a s s a y s s h o w e d t h a t m y c o b a c t e r i u m
14、t u b e r c u l o s i s MV s c o u l d r e d u c e t h e s u r v i v a l o f TH P-1-d e r i v e d m a c r o p h a g e s a n d p r o m o t e a p o p t o s i s.C o n c l u s i o n s M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s MV s a r e r i c h i n s h o r t R NA f r a g m e n t s,w h i c h h a
15、v e t h e e f f e c t o f i n d u c i n g a p o p t o s i s.H o w e v e r,i t s s p e c i f i c m e c h a n i s m s t i l l n e e d s m o r e i n-d e p t h a n d d e t a i l e d s t u d y.【K e y w o r d s】M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s;M e m b r a n e v e s i c l e s;R NA s e q u
16、e n c i n g;A p o p t o s i sF u n d P r o g r a m s:N a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f C h i n a(8 2 3 7 2 2 6 0,8 2 1 0 0 0 1 1),B e i j i n g N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n H a i d i a n O r i g i n a l I n n o v a t i o n J o i n t F u n d(L 2 0
17、2 0 2 3)2 8 中国医学前沿杂志(电子版)2 0 2 4年第1 6卷第3期基金项目:国家自然科学基金(8 2 3 7 2 2 6 0,8 2 1 0 0 0 1 1);北京市自然科学基金海淀原始创新联合项目(L 2 0 2 0 2 3)通信作者:刘秋月 E-m a i l:l i u q i u y u e b j x k y y.c n重点号专题 结核病(t u b e r c u l o s i s,T B)仍然是最致命的传染病之一,对全球公众健康构成严重威胁。根据世界卫生组织发布的 2 0 2 3年 全球结核病 报告,2 0 2 2年估计有1 0 6 0万人感染结核分枝杆菌,1
18、3 0万人死于结核病1。中国新发结核病病例约为7 4.8万例,死亡病例约为3万例1。结核病的防治形势依然十分严峻。结核分 枝 杆 菌 是 典 型 的 胞 内 寄 生 菌,感 染机体后首 先寄生于 巨 噬 细 胞 内,一 般 认 为,结核感染发生发展过程中伴随着免疫细胞的凋亡,其中的结核分枝杆菌随着宿主巨噬细胞凋亡被杀灭,抑制其 在体内 播 散,并 可 激 活 其 他 未 感染的巨噬细 胞,进一步强 化机体对 病 原 菌 的 杀伤作用2。研究 表 明,培 养 具 有 活 性 的 结 核 分 枝 杆 菌(而非热灭活的)可以诱发巨噬细胞凋亡3,这提示结核分枝杆菌可通过释放/分泌活性物质诱发细胞凋亡。
19、最近,研究人员通过层析技术对结核分枝杆菌实验室参考株H 3 7 R v的体外培养液中的活性分子按照分子量大小分离的组分分别进行细胞凋亡实验,结果显示,诱发巨噬细胞凋亡的主要物质为一类低分子量的R NA分子,而非蛋白质或脂类4。研究这些R NA分子的来源及鉴定与细胞凋亡相关的R NA为寻找治疗结核病的干预靶标提供新的思路。近来,原核及真核生物体中普遍存在的、进化保守的分泌途径 细胞外膜泡被发现5。研究报道,结核分枝杆菌也可以在体内或体外主动分泌直径为5 03 0 0 n m的膜囊泡(m y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s m e m b
20、 r a n e v e s i c l e s,MV s),其 中 包裹着多种病原相关分子模式(p a t h o g e n-a s s o c i a t e d m o l e c u l a r p a t t e r n s,P AMP s),包括核酸、脂类和蛋白质等,可运输至宿主细胞调控多种细胞免疫反应,如调节促炎因子和细胞因子等的释放5-6。目前,已有研究报道结核分枝杆菌MV s中含有蛋白质和脂类,P r a d o s-R o s a l e s等7在结核分枝杆菌MV s中也检测到D NA。然而结核分枝杆菌MV s中R NA表达谱及其对细胞凋亡的作用至今仍不清楚。本研究拟以结
21、核分枝杆菌及其MV s为研究对象,描绘MV s的R N A特征表达谱,分析其主要的生物功能,初步探索其诱导巨噬细胞凋亡的生物学功能,为进一步深入研究其作用机制提供新思路。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞系和菌株 本实验采用细胞系为人源单核巨噬细胞系TH P-1(购于北京协和细胞库),菌株为结核分枝杆菌实验室标准菌株H 3 7 R v(由国家结核病临床参比实验室提供)。1.1.2 仪器与试剂 J EM-1 4 0 0型透射电镜(美国F E I公 司),G u a v a流 式 细 胞 仪(g u a v a e a s y-C y t e 8,美国L u m i n e x公司),N
22、a n o S i g h t纳米颗粒跟踪仪(N S 3 0 0,英国M a l v e r n仪器有限公司)。R PM I-1 6 4 0培养基(美国G i b c o公司),A n n e x i n V-F I T C凋亡检测试剂盒(a b 1 4 0 8 5,美国A b c a m公司),胎牛血清(美国H y c l o n e公司)。1.2 方法1.2.1 结核分枝杆菌MV s分离及形态鉴定 7 H 9液体 培 养 基(含1 0%促 生 长 添 加 剂OA D C,0.5%吐 温8 0)复 苏、扩 大 培 养 结 核 分 枝 杆 菌H 3 7 R v,至O D6 0 01.0,离心收
23、集H 3 7 R v菌体,磷酸盐缓冲液清洗2次后接种于苏通培养基(含5%甘油)中,继续培养3周。结核分枝杆菌培养液中MV s的分离及形态检测方法参考本课题组已建立方法8:离心去除菌体并收集上清,0.2 2 m 滤器过滤除菌,采用相对分子质量为1 0 0 k D a的孔径膜经超滤杯超滤浓缩,差速离心去除细胞碎片和大分子蛋白复合物,最后通过1 2 0 0 0 0 g超速离心4 h收集结核分枝杆菌膜囊泡,磷酸盐缓冲液清洗2次。通过透射电镜(J EM-1 4 0 0)和N a n o s i g h t颗粒追踪分析技术(N S 3 0 0,英国M a l v e r n仪器有限公司)对膜囊泡的大小、形
24、态及粒径分布进行检测,评估其完整性和纯度。1.2.2 结核分枝杆菌MV s R NA测序及分析 分离结核分枝杆菌培养上清中膜囊泡,T r i z o l 裂解法提取总R NA,A g i l e n t 2 1 0 0对R NA样品质检,构建R NA(1 88 0 n t)文库。以打断后mR NA片段为模板,随机引物合成第一链c D NA,随后加入缓冲液、d NT P s(用d UT P 取代d T T P)和D NA p o l y m e r a s e 合成第二链c D NA后用U S E R酶降2 9 中国医学前沿杂志(电子版)2 0 2 4年第1 6卷第3期重点号专题解c D NA(
25、含U)第二链。经末端修复、加p o l y A尾并连接测序接头,P C R扩增并纯化P C R 产物,将得到的扩增产物稀释至1.5 n g/l,采用A g i l e n t 2 1 0 0 对文库的插入片段大小进行检测,采用Q-P C R对 文 库 的 有 效 浓 度 进 行 定 量(有 效 浓 度 2 n m o l/L),采用i l l u m i n a H i s e q 2 5 0 0-S E 5 0平台进行双端测序。对测序得到的原始测序序列(r a w r e a d s)进行过滤,使用BW A(B u r r o w s-W h e e l e r A-l i g n e r)
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 结核 分枝杆菌 膜囊泡 RNA 表达 谱分析 功能 研究
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。