血清Ⅱ型鸡马立克氏病毒的分离鉴定及SW14分离株pp24基因的序列分析.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 8 期2023 年 8 月Vol.45,No.8Aug.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202208019血清II型鸡马立克氏病毒的分离鉴定及SW14分离株基因的序列分析林雨萌,胡明雪,刘长军,葛成菲,郭榕容,李凯,崔红玉,高立,祁小乐,王素艳,王笑梅,高玉龙*,张艳萍*(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 动物疫病防控全国重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150069)摘要:为了解鸡马立克氏病毒(MDV)在我国鸡群中的流行情况,本研究于2
2、021年从福建省已免疫鸡马立克氏病(MD)疫苗鸡群且发生疑似MD病例的鸡场采集21份疑似发病蛋鸡外周血,分离其淋巴细胞接种鸡胚成纤维细胞(CEF),5 d后收集病毒,盲传12代后获得21株能够形成典型MDV蚀斑的分离株,依次命名SW1SW21,采用PCR分别扩增MDV血清I型(MDV-1)基因、II型(MDV-2)基因、III型(MDV-3)基因进行MDV分型鉴定,扩增鸡传染性贫血病毒(CAV)基因、禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)基因、禽白血病病毒A亚群(ALV-A)、B亚群(ALV-B)、J亚群(ALV-J)的基因进行外源病毒检测,结果显示MDV-1均为阴性,MDV-2均为阳性,MDV-
3、3阳性率为38.1%(8/21),未检测到外源病毒基因。在MDV-2分离株中选择SW14株进行基因的PCR扩增,测序后与MDV-2参考株SB-1、301B/1、HPRS24的基因进行基因序列比对分析,结果显示,SW14和SB-1株同源性(96.3%)最高。通过透射电镜观察SW14,可见分离株呈双环型,直径约110 nm,符合MDV病毒粒子形态特征。本研究证实该鸡场中存在MDV-2流行,可能会影响疫苗的免疫效果,但其致病性有待进一步研究。本研究从疑似发病蛋鸡中分离到新的MDV-2株,为我国MDV-2的研究提供重要参考依据,同时为我国MD疫情防控提供有价值的研究材料。关键词:鸡马立克氏病毒;分离鉴
4、定;血清II型;血清III型;基因序列分析中图分类号:S852.65文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)08-0864-05Isolation and identification of field Mareks disease virus strainsserotype 2 and sequence analysis ofgene in SW14 isolatesLIN Yu-meng,HU Ming-xue,LIU Chang-jun,GE Cheng-fei,GUO Rong-rong,LI Kai,CUI Hong-yu,GAO Li,QI Xiao-le,WANG
5、Su-yan,WANG Xiao-mei,GAO Yu-long*,ZHANG Yan-ping*(State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agriculture Sciences,Harbin 150069,China)Abstract:To investigate the prevalence of Mareks disease virus(MDV)in chickens,we collecte
6、d 21 peripheral bloodsamples of suspected MDV-infected layers from immunized chicken farms in Fujian Province in 2021.Lymphocytes were isolatedand inoculated into chicken embryo fibroblasts(CEF),resulting in the isolation of 21 strains capable of forming typical MDVplaques,which were named SW1 to SW
7、21.MDV typing was performed by PCR to qualify thegene of MDV serum type I收稿日期:2022-08-29基金项目:国家自然科学基金(U21A20260、32170170);现代农业产业体系肉鸡体系(CARS-41)作者简介:林雨萌(1996-),女,黑龙江哈尔滨人,硕士研究生,主要从事禽免疫抑制病研究.*通信作者:E-mail:;*Corresponding author(MDV-1),thegene of type II(MDV-2),and thegene of type III(MDV-3).Amplificatio
8、n of chicken anemia virus(CAV)gene,thegene of reticuloendotheliosis virus(REV),thegene of subgroup A,B,J avian leucosis virus(ALV)was performed to test for foreign viruses.The results showed that all MDV-1 types were negative,while MDV-2 typeswere positive,with MDV-3 types accounting for 38.1%(8/21)
9、,and no foreign virus genes were detected.SW14 was selected fromMDV-2 isolates forgene amplification and nucleotide sequence alignment analysis with MDV-2 reference strains SB-1,301B/1 and HPRS24.The results revealed the highest homology(96.3%)between SW14 and SB-1.The SW14 was observed bytransmissi
10、on electron microscopy,and the findings were consistent with the morphological characteristics of MDV particles.Thisstudy indicates the prevalence of MDV-2 in the studied flock,which could potentially affect the vaccines immune response,though further research is required to assess its pathogenicity
11、.In this study,the isolation of a new MDV-2 strain from suspecteddisease-onset layer chickens provided a crucial theoretical foundation for the investigation of MDV-2 and valuable researchmaterials for the prevention and control of local MD epidemics in China.Key words:Mareks disease virus;isolation
12、 and identification;serotype 2;serotype 3;gene sequence analysis鸡马立克氏病(Mareks disease,MD)是由鸡马立克氏病毒(Mareks disease virus,MDV)引起的以淋巴组织增生性肿瘤为主要特征的免疫抑制性传染病,造成养禽业经济损失。MDV是一种高度细胞结合的琢疱疹病毒1,根据生物学和血清学特点可将MDV分为3个血清型,分别为血清I型(MDV-1)、II型(MDV-2)和III型(MDV-3),其中只有MDV-1可引起鸡 的 肿 瘤,该 型 依 据 致 病 力 进 一 步 分 为 温 和(mMDV)、强(
13、vMDV)、超 强(vvMDV)和 特 超 强(vv+MDV)株。而其他2个血清型则不引起鸡的肿瘤2。其中MDV-2自然无毒力、无致瘤性,但具有免疫保护作用的病毒株,如国外分离的SB-1、HPRS24株等,国内分离的Z4株。MDV-3包括HVT、FC126株等。MDV基因组长约180 kb,包括6个区分别为长独特序列区(UL)、短独特序列区(US)、长末端重复序列(TRL)、长内部重复序列(IRL)、短末端重复序列(TRS)、短内部重复序列(IRS)。20世纪70年代,我国已有不少地方发生MD的流行和危害3,由于病毒不断变异,尽管接种了MD疫苗,一些国家仍出现MDV免疫逃逸现象4,从1973年
14、我国首次分离到MDV以来,陆续分离到的不同致病性病毒株均属于MDV-1。然而,自1988年首次分离到MDV-2 Z4株后,国内关于这种对鸡体的淋巴器官不发生溶细胞现象、不出现法氏囊和胸腺萎缩、肿瘤发生的病毒株报道很少。2021年,在福建省某养鸡场出现MD疫苗免疫蛋鸡发生疑似MD病例,从采集的21份疑似发病鸡外周血分离到21株MDV,通过PCR进行MDV分型鉴定和外源病毒基因检测,发现存在MDV-2及MDV-2与MDV-3混合感染。本研究在疑似发病蛋鸡中分离得到SW14并进行基因扩增,发现其与现有登录的MDV-2基因序列均不同,为MD的监测和研究提供了基础数据。1材料与方法1.1主要实验材料21
15、份抗凝血(13 mL/只),采集自福建某蛋鸡均疑似MDV感染鸡(1日龄时免疫CVI988+HVT二价MD疫 苗,200日龄时肿瘤发生率1%2%)。MDV-1代 表 株 GA株、MDV-2代 表 株SB-1株和MDV-3代表株HVT疫苗株,DH5琢,鸡胚或纤维细胞(CEF)均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病实验室保存。无特定病原体(SPF)鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。鸡外周血淋巴细胞分离液KIT购自天津灏洋生物公司;M199培养液和犊牛血清购自Invitrogene公司;PCR反应用试剂、pMD18-T载体和DL2000 DNA Marker,购自宝生物工程
16、(大连)有限公司;DNA提取试剂盒购自AxyGen公司;DNA胶回收试剂盒购自OMEGA公司。1.2引 物 的 设 计 与 合 成根 据 GenBank 登 录 的HPRS24株全基因组序列(AB049735.1)5,利用Oligo 7软件设 计引物,分 别用于 鉴 定 MDV-2的特 异 性基因6-7和基因(表1)。引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。1.3病毒分离和目的基因的扩增及其编码蛋白的生物学分析将21份鸡抗凝血采用鸡外周血单个核淋巴细胞(PBMC)分离液试剂盒分离PBMC,将PBMC分别接种于CEF,光学显微镜下连续观察5 d,盲传林雨萌,等.血清 II 型鸡马立克氏病毒的分
17、离鉴定及 SW14 分离株基因的序列分析第 8 期86512代,待细胞病变(CPE)达到60%后,收集感染的细胞,液氮冻存。根据常规方法提取上述21份传代细胞DNA作为模板,根据文献8-10,采用PCR分别通过扩增MDV-1、MDV-3、CAV、ALV、REV的特异性基因检测是否有相应病原感染;同时,扩增MDV-2的、基因,反应条件为:95 5 min;94 1 min,56 30 s,72 1 min,30个循环;72 10 min,4 保存。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测并胶回收纯化基因扩增产物,送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。利用DNAStar软件对分离株测序序列拼接,利用Me
18、gAlign软件与GenBank登录的MDV-2参考株基因及其编码氨基酸序列比对分析。采用Protparam SOPMA在线软件分析分离株pp24蛋白的理化性质,预测pp24蛋白的二级结构。利用SingalP5.0、TMHMM2.0 Server在线软件分别预测该蛋白的信号肽和跨膜结构域。1.4分离病毒的形态学观察选取1株MDV-2分离株接种CEF,待出现80%以上CPE后,收获细胞培养物,制备超薄切片,依次用醋酸双氧铀、柠檬酸铅双重染色,通过透射电子显微镜观察病毒粒子的形态及分布11。2结果与讨论2.1病毒的分离鉴定结果将分离的21份PBMC细胞分别接种CEF,进行病毒分离。每天于倒置显微镜
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