鸭疫里默氏杆菌AS87_05150基因缺失株的构建及部分生物学特性分析.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 10 期2023 年 10 月Vol.45,No.10Oct.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202302024鸭疫里默氏杆菌AS87_05150基因缺失株的构建及部分生物学特性分析单兴根1,2,田祥强2,3,王佳玲2,谢维娜1,田朋1,胡志群1,2,高永恒1,2,嵇辛勤3,吴金节1*,胡青海2*(1.安徽农业大学 动物科技学院,安徽 合肥 230036;2.中国农业科学院 上海兽医研究所,上海 200241;3.贵州大学 动物科
2、学学院,贵州 贵阳 550025)摘要:为探究鸭疫里默氏杆菌(RA)IX型分泌系统(T9SS)分泌的假定蛋白AS87_05150的功能,本研究采用自杀质粒同源重组的方法构建RA Yb2株AS87_05150基因缺失株Yb2驻5150及其回补株cYb2驻5150,经PCR及测序鉴定,结 果 显 示 AS87_05150 基 因 缺 失 株 Yb2驻5150 和 回 补 株 cYb2驻5150 均 正 确 构 建,缺 失 株 的 表 型 为 16SrRNA+AS87_05150 ORF-,回补株的表型为16S rRNA+AS87_05150 ORF+。采用荧光定量PCR(qPCR)检测Yb2、Yb
3、2驻5150和cYb2驻5150株AS87_05150基因的转录水平;根据上述3株菌不同时间的OD600nm值绘制各菌株的生长曲线;采用微量结晶紫法检测各菌株生物被膜(BF)的形成能力;将107cfu/孔的Yb2、Yb2驻5150和cYb2驻5150株分别感染Vero细胞,检测各菌株对Vero细胞的黏附和侵袭力。qPCR检测结果显示,cYb2驻5150株中AS87_05150 mRNA相对转录水平比Yb2株高约19倍(0.0001),Yb2驻5150株未扩增到AS87_05150基因;生长曲线结果显示,Yb2驻5150与Yb2株的生长曲线基本一致,但cYb2驻5150生长速度与Yb2驻5150
4、株相比极显著下降(0.01);BF测定结果显示,Yb2驻5150和cYb2驻5150株BF的形成能力与Yb2株相比均极显著降低(0.0001);黏附和侵袭力结果显示,这3株菌对Vero细胞的黏附和侵袭力均无显著差异。将3株菌分别以108cfu/只104cfu/只、1010cfu/只106cfu/只和109cfu/只105cfu/只的剂量经肌肉注射接种雏鸭,感染后观察雏鸭的发病情况,并采用Reed-Muench法计算3株菌对雏鸭的半数致死量(LD50);将3株菌均以107cfu/只经肌肉注射感染雏鸭,24 h后剖杀,无菌采集各组鸭血液、肝脏和脑组织,作相应处理后涂板采用平板计数法测定载菌量。根据
5、各组鸭的死亡情况,计算Yb2、Yb2驻5150和cYb2驻5150株的LD50分别为6.85伊105cfu、8.75伊107cfu和4.681伊108cfu,即缺失株LD50比野生株高约127倍,但回补株的LD50比缺失株高约5倍。载菌量测定结果显示,Yb2驻5150株和cYb2驻5150株感染鸭血液、肝脏、脑组织中的细菌载量比Yb2株感染鸭的载菌量均极显著降低(0.001),但前两者之间上述指标均无显著差异。本实验结果表明AS87_05150与RA Yb2株的BF形成和致病性相关,但回补株对雏鸭的毒力和致病性均未回复到野生株的水平。本研究为进一步解析RA AS87_05150的功能及分子致病
6、机制等奠定了基础。关键词:鸭疫里默氏杆菌;型分泌系统(T9SS);基因缺失;生物被膜;致病性中图分类号:S852.61文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)10-1001-07Construction and partial biological characteristics analysis ofAS87_05150 deletion mutant ofSHAN Xing-gen1,2,TIAN Xiang-qiang2,3,WANG Jia-ling2,XIE Wei-na1,TIAN Peng1,收稿日期:2023-02-26基金项目:国家自然科学基金(31772770
7、);上海市自然科学基金(23ZR1476700)作者简介:单兴根(1997-),男,山东聊城人,硕士研究生,主要从事动物病原细菌方向研究.*通信作者:E-mail:;*Corresponding authorHU Zhi-qun1,2,GAO Yong-heng1,2,JI Xin-qin3,WU Jin-jie1*,HU Qing-hai2*(1.College of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China;2.Shanghai Veterinary Research Ins
8、titute,CAAS,Shanghai 200241,China;3.College of Animal Science and Technology,Guizhou University,Guiyang 550025,China)Abstract:To investigate the function of hypothetical protein AS87_05150 secreted by the type IX secretion system(T9SS)of(RA),in this study,a mutant Yb2驻5150 defective of AS87_05150 wa
9、s constructed by homologousrecombination using suicide plasmid,and the complementary strain cYb2驻5150 was also generated,and then their relevantbiological characteristics were analyzed.The constructed strains were identified by PCR,and the phenotype of the strainYb2驻5150 and cYb2驻5150 was 16S rRNA+A
10、S87_05150 ORF-and 16S rRNA+AS87_05150 ORF+,respectively.The mRNAtranscription levels of AS87_05150 in Yb2,Yb2驻5150 and cYb2驻5150 strains were detected using fluorescence quantitative PCR(qPCR),the growth curves of each strain were plotted based on the OD600nmvalues at different times,the biofilm for
11、mation(BF)ofeach strain was examined using crystal violet method,and the Vero cells were infected with 107cfu of Yb2,Yb2驻5150 andcYb2驻5150 strains,respectively,to test the adhesion and invasion capacities of each strain.The results of qPCR showed that therelative mRNA transcription level of AS87_051
12、50 in cYb2驻5150 was about 19 times higher than that in the wild type Yb2(0.0001),and no mRNA of AS87_05150 was detected in Yb2驻5150.There was no significant difference in the growth curvebetween Yb2驻5150 and Yb2,while the growth of cYb2驻5150 was significantly slower compared to Yb2驻5150(0.01).Crysta
13、lviolet staining showed that the BF of Yb2驻5150 and cYb2驻5150 was significantly reduced compared to that of Yb2(0.0001).There was no significantly difference in the adhesion and invasion capacities of these three strains to Vero cells.The ducklingswere inoculated intramuscularly with Yb2,Yb2驻5150 an
14、d cYb2驻5150 at the dose of 108-104cfu/duckling,1010-106cfu/ducklingand 109-105cfu/duckling,respectively.The incidence of ducklings was observed after infection,and the median lethal doses(LD50)was calculated with Reed-Muench method.It showed that the LD50of Yb2,Yb2驻5150 and cYb2驻5150 was 6.85伊105cfu
15、,8.75伊107cfu and 4.681伊108cfu respectively,that is,the LD50of Yb2驻5150 was about 127 times higher than that of Yb2.The threestrains were injected intramuscularly into ducklings at the dose of 107cfu,and the blood,liver and brain tissues of each group werecollected after 24 hours,and the bacterial lo
16、ad was measured by plate counting after corresponding treatment.The results showedthat the bacterial loads in the blood,liver,and brain tissues of Yb2驻5150 or cYb2驻5150 infected ducklings was significantly lowerthan those of Yb2 infected ducklings(0.001),and there was no significant difference betwe
17、en Yb2驻5150 and cYb2驻5150group.The results of this study suggested that AS87_05150 is involved in biofilm formation and pathogenicity of RA strain Yb2,however,the virulence of the cYb2驻5150 to ducklings did not restored to the level of the wild strain.This study laid a foundationfor further research
18、 on the functions of AS87_05150 and molecular pathogenesis of.Key words:;type IX secretion system(T9SS);gene deletion;biofilm;pathogenicity鸭疫里默氏杆菌(,RA)是拟杆菌门黄杆菌目威克斯氏菌科里默氏杆菌属的代表种1,主要感染肉用鸭(如:樱桃谷鸭、北京鸭、番鸭、半番鸭和野鸭等)、鹅、火鸡、鸡和其他禽类,是当今危害全世界养鸭业的一种主要病原菌。目前已鉴定的RA血清型至少有21种2-3,其中血清1、2型是我国RA流行株的优势血清型,其他血清型的分布有一定的区域性
19、4。但不同菌株间,甚至是同一血清型的不同菌株间的致病性均存在较大差异。虽然目前已经鉴定了RA的一些毒力相关基因,但对其具体的分子致病机制还知之甚少。T9SS(Type secretion system)是拟杆菌门细菌特有的一种分泌系统,与细菌的营养获取、信息交换、抵御环境影响以及致病性等相关5,研究表明RA T9SS核心组分GldK的编码基因缺失后,其对雏鸭的致病性显著降低6,提示T9SS可能分泌与RA致病性相关的蛋白。T9SS能够识别并转运携带T9SS相关C末端结构域(CTD)的蛋白7。保守结构域的预测结果显示AS87_05150蛋白C端含T9SS相关CTD结构域,推测AS87_05150蛋
20、白是由T9SS分泌,但该蛋白的生物学功能尚不清楚。为 此,本 研 究 构 建 血 清 2 型 RA Yb2 株 的AS87_05150基因缺失株和回补株,并分析AS87_05150基因缺失后对Yb2株的生长性能、生物被膜中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1002(BF)形成、对Vero细胞的黏附及侵袭力和对雏鸭致病性等的影响,为解析AS87_05150蛋白的生物学功能及疫苗的研究等提供参考。1材料与方法1.1主要实验材料血清2型RA Yb2株、大肠杆菌S17-1、自杀性质粒pYT354、穿梭质粒pRES和非洲绿猴肾细胞(Vero)均由本实验室保存。实验用雏鸭购自江苏丽佳禽业有限公司;T
21、RIzol购自天根生化生物科技(北京)有限公司;Q5 DNA高保真聚合酶、限制性核酸内切酶和T4 DNA连接酶均购自NEB公司;反转录试剂HiScript RT SuperMix和ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司。1.2引物的设计与合成及Yb2株AS87_05150蛋白氨 基 酸 保 守 结 构 域 的 预 测根 据 RA Yb2 株(NZ_CP007204)AS87_05150基因及其上下游基因序列,采用Primer3在线软件设计引物(表1)。5150-LF/R和5150-R F/R用于构建同源重组的AS87_05150
22、基因上下游同源臂;5150-c F/R用于扩增AS87_05150ORF构建回补株;5150-d F/R、16S-F/R及cfxA-F/R用于缺失株及回补株的鉴定。引物均由北京擎科生物科 技 股 份 有 限 公 司 合 成。利 用 NCBI 网 站 中 的CD-search程序(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测Yb2株AS87_05150蛋白氨基酸序列保守结构域。1.3Yb2株AS87_05150基因缺失株和回补株的构建与鉴定本研究采用自杀质粒同源重组的方法构建AS87_05150基因缺失株。以提取的Yb2株基因组DN
23、A作为模板,采用表1中的5150-L F/R引物,以Q5高保真聚合酶经PCR扩增AS87_05150基因上下游同源臂L和R,分别连接pMD19-T载体测序后,再将AS87_05150基因上下游同源臂分别克隆至自杀质粒pYT354中,构建重组自杀质粒p354-5150-LR,并经PCR扩增及测序鉴定正确后转化感受态细胞S17-1,获得重组菌p354-5150-LR/S17-1,之后通过接合转导法8将该重组自杀质粒导入野生株Yb2中。将采用引物5150-d F/R和16S-F/R经PCR鉴定的阳性接合子在含10%蔗糖的TSA平板划线培养36 h后挑单菌落,采用RA 16S rRNA鉴定引物16S-
24、F/R和5150-d F/R经菌液PCR和测序鉴定,并经菌落纯化获得AS87_05150 ORF基因缺失株Yb2驻5150。以Yb2基因组DNA作为模板,采用引物5150-cF/R以Q5高保真聚合酶经PCR扩增AS87_05150 ORF,克隆至pMD19-T载体测序鉴定正确后,经酶切后克隆至pRES质粒中9-10,使AS87_05150 ORF直接位于pRES质粒中启动子9的下游,构建重组质粒pRES-c5150。经PCR和测序鉴定正确后,转化感受态细胞S17-1,获得重组菌pRES-c5150/S17-1,再通过接合转导的方法将该重组质粒导入缺失株Yb2驻5150中,用含50 滋g/mL卡
25、那霉素、0.3 滋g/mL头孢西丁的TSA筛选培养基培养24 h后挑单菌落采用引物16S-F/R、cfxA-F/R和5150-d F/R分别经PCR和测序鉴定,得到回补株cYb2驻5150。1.4各菌株中AS87_05150基因mRNA相对转录水平的荧光定量PCR(qPCR)检测将Yb2、Yb2驻5150和cYb2驻5150株分别在TSB培养基中培养至OD600nm值为1.0,分别取1 mL菌液采用TRIzol法提取总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用引物5150-RT F/R经qPCR扩增AS87_05150基因,以NADH基因作为内参8。采 用 2-驻驻Ct法11计 算 野 生 株、缺
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