生物质谱在生物制品宿主细胞蛋白残留分析中的应用.pdf
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1、第45卷第2 期2024年3月质谱学报Journal of Chinese Mass Spectrometry SocietyVol.45No.2Mar.2024生物质谱在生物制品宿主细胞蛋白残留分析中的应用谢力琦,王静,朱添怡1,王佳馨1,黄(1.上海探实生物科技有限公司,上海2 0 12 0 6;2.复旦大学化学系,上海2 0 0 438)懿,乔亮?摘要:宿主细胞蛋白(hostcellproteins,H C Ps)残留影响生物制品的质量和安全,是生物制品生产的关键质控要素。目前,HCPs残留的主要质控方法是酶联免疫吸附试验(ELISA),但该方法的准确性高度依赖于抗体的特异性,且无法获得
2、HCPs的种类及其含量分布信息,需要使用正交方法全面监测。而生物质谱技术无需依赖抗体即可实现HCPs的定性和定量分析,已逐渐成为除ELISA法外的主要分析表征方法,但质谱技术存在缺乏统一的操作流程和验证标准、高丰度药物信号抑制以及高昂的仪器成本等问题。本文总结了质谱法在生物制品HCPs分析中的工作流程及其应用进展,详细阐述了流程中涉及的样品准备、液相色谱分离、质谱数据采集、质谱数据分析和报告的开发原则和关键方法参数,并对未来的研究方向及挑战进行展望。关键词:宿主细胞蛋白;生物质谱;生物制品;质量控制中图分类号:0 6 57.6 3doi:10.7538/zpxb.2023.0134Progre
3、ss in Residual Host Cell Proteins Analysisof Biologics by Mass Spectrometry文献标志码:A文章编号:10 0 4-2 9 9 7(2 0 2 4)0 2-0 19 3-0 8XIE Li-qi,WANG Jing,ZHU Tian-yi,WANG Jia-xin,HUANG Yi,QIAO Liang?(1.Shanghai Tanshi Biotechnology Co.,LTD,Shanghai 201206,China;2.Department of Chemistry,Fudan University,Shang
4、hai 200438,China)Abstract:Residual host cell proteins(HCPs)can significantly impact the efficacy andsafety of biologics,and are considered as critical quality attributes that require rigorousquality control.Currently,the enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)is themost common methodology for monit
5、oring residual HCPs in biologics.However,theaccuracy of ELISA is highly dependent on the specificity of the used antibodies,and itdoes not provide informations about the types and quantities of individual HCP,makingit necessary to complement ELISA with other analytical methods.Mass spectrometry(MS)h
6、as emerged as key analytical and characterization technique for HCPs analysis.Without solely depending on antibody affinity recognition,MS enables the identificationand quantification of individual HCP,which facilitates a deeper understanding of HCPprofiles,clearance patterns,risk assessment,and pro
7、blematic HCP monitoring.本文通信作者乔亮194Moreover,the method of liquid chromatography coupled with tandem mass spectrome-try(LC-MS/MS)offers faster development for new products.Despite its advantages,LC-MS/MS faces challenges in HCP analysis,such as the lack of standardized proce-dures and validation stan
8、dards,signal suppression in the presence of high-abundanceactive pharmaceutical ingredient(API),and the high instrumentation cost and special-ized expertise barriers in routine quality control settings.Researchers and industryexperts are working towards establishing standardized procedures and valid
9、ation guide-lines for HCPs analysis using LC-MS/MS,which includes utilizing data dependentacquisition(DDA)for the construction of project-specific HCP libraries,data independ-ent acquisition(DIA)for efficient HCP screening,and targeted strategy like multiplereaction monitoring(MRM)for absolute quant
10、ification of high-risk HCPs.Efforts arealso underway to mitigate signal suppression effects and reduce instrumentation costs.To overcome high-abundance API interference in HCP detection,advanced techniquesinvolving API-HCP separation,HCP enrichment,and non-denaturing enzymatic diges-tion have been d
11、eveloped,allowing for the monitoring of HCPs at exceptionally lowlevels(0.1 to 0.01 ppm).This paper provided an overview of MS-based HCPs analysisworkflow utilized“proteomics”approach,covering essential considerations in instru-ment selection,sample preparation,LC separation,MS data acquisition,and
12、data anal-ysis and reporting,corresponding optimized practices were discussed.Nowadays ELISAis still a workhorse for residual HCP analysis,however,LC-MS/MS is a valuable toolfor the analysis of residual HCPs in biologics.It offers a more comprehensive anddetailed view of HCP profiles and their clear
13、ance patterns throughout the productionprocess,enabling better risk assessment and monitoring of problematic HCPs.Whilechallenges remain,ongoing research and development efforts are paving the way for thebroader adoption of LC-MS/MS in the biopharmaceutical industry,ultimately ensuringthe quality an
14、d safety of biologic products.Key words:host cell proteins(HCPs);mass spectrometry(MS);biologics;qualitycontrol宿主细胞蛋白(host cell proteins,H C Ps)是在生物制品生产过程中由宿主细胞表达并残留在产品中的工艺相关蛋白质杂质!。HCPs残留的种类由宿主细胞类型和亚型决定,其含量受表达体系、表达方式、纯化工艺和药物种类的影响。每种HCP都有其独特的理化活性和生物功能,部分高风险型HCPs能引起免疫原性而发生临床安全性风险,也可能引起药物降解而影响产品质量,需要严密
15、监控 2 。如,在一种抗白介素13的抗体的期临床试验中,90%受试者因为宿主细胞中的PLBL2蛋白残留产生了免疫反应 3;有研究 4发现,在一款重组Fc融合蛋白产品中,来源于宿主细胞的组织蛋白酶D可引发药物降解,导致药效降低。生物质谱学报第45卷制品制剂处方中常见的聚山梨醇酯8 0 和聚山梨醇酯2 0 等稳定剂可能会被脂肪酶家族的HCPs降解,从而影响药物本身的长期稳定性 5。基于此,在绝大多数情况下,HCPs残留被认为是生物制品的关键质量属性,需要在成品和原液的放行检测以及中间产品的工艺控制中重点关注 5。在生物制品的生产过程中,应尽量去除HCPs,或将其控制在不妨碍产品安全有效性的范围内。
16、由于HCPs 种类繁多、性质各异且分子质量差距较大,在纯化工艺开发过程中预测其清除效率极具挑战。抗体药物典型的纯化流程及各阶段产品的HCPs水平示于图1。纯化流程通常包括深层过滤、亲和色谱以及2 3次正交色谱分离。细胞培养发酵液第2 期中的HCPs含量通常在10 510 ppm水平,其中大部分在亲和色谱(如蛋白A亲和纯化)阶段被去除至约10 0 0 ppm,其余与药物有相互作用或与层析柱有非特异结合的部分HCPs在后续阴阳离子色谱纯化步骤得到进一步清除 C6-7。抗体药物下游纯化深层过滤蛋白A亲和纯化阳离子色谱阴离子色谱除病毒过滤超滤置换/原液图1抗体药物纯化工艺流程对应的HCPs水平Fig.
17、1 Typical HCPs level during purificationprocess for monoclonal antibodies(mAbs)对于经纯化后仍残留于生物制品中低至ppm级别的HCPs8,尤其是高风险型HCPs的质量控制,如何实现准确的定性和定量分析,对生物制品的质量控制以及工艺开发尤为关键。1生物制品宿主细胞残留的分析方法和质谱技术的优势测定生物制药中残留的宿主细胞蛋白的方法主要包括基于特异性抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹法,以及以液相色谱-质谱(LC-MS)法为代表的非免疫特异性方法 9-10 。ELISA法因高可及性、高灵敏度及低定量限一度成为
18、生物制品HCPs放行检测及工艺控制的金标准 11。双抗夹心法ELISA与竞争性ELISA相比,大大提高了检测的灵敏度和特异性,是检测HCPs最常用的一种ELISA方法 9。对于常见的生产用细胞株或菌株,有商品化的夹心法ELISA试剂盒供选择 2 在早期研究中经初步评估后可直接选用相应的试剂盒进行检测。ELISA法对 HCPs 分析的准确性高度依谢力琦等:生物质谱在生物制品宿主细胞蛋白残留分析中的应用关的风险评估。质谱法可以在单次实验中鉴定和定量多种HCPs,且不存在抗体法对无亲和力或低亲和力HCPs的歧视,可应用于生物制品全生命周期中HCPs的监控 17 。基于LC-MS/MS的HCPs检测方
19、法在生物制品生命周期中的应用示于图2。在生物制品研发初期确定生产用细胞后,即可使用LC-MS法对下罐料液进行蛋白质组分析,建立特定的HCP库,确认可能残留于产品中的HCPs类型。随着工艺开发,LC-MS法可评估纯化工序对HCPs的清除效率,并鉴定易在工艺步骤中持续存在的顽固HCPs 和共洗脱HCPs,辅助工艺的优化和锁定 2.18 1。如果在原液或成品中发现可能影响产品安全有效性的高风险HCPs,可应用靶向LC-MS 技术实现定量监测 12 2021年,生物制药新兴最佳实践协会(BEBPA)的HCP论坛调研报告显示,有6 2%生物制药企业使用质谱法进行HCPs监测以指导工艺开发。此外,对于缺乏
20、商品化ELISA试剂盒的宿主细胞,开发试剂盒需要12 年的周期,而LC-MS法的开发可在1个月内完成,能够快速应用于残留HCPs的检测 9。2 0 2 1年,195赖于所使用抗体的覆盖率,无法被抗体特异性识别或低亲和力的HCPs可能会被漏检或低估,同时也可能高估高亲和力的HCPs含量,导致结果不准确 9。因此,在关键临床样本及商业放行测试前,需评估试剂盒抗体对HCP蛋白组的覆盖率。若覆盖率不足,需开发特异的自制试剂盒。此外,特异性抗体方法只能定量HCPs含量分析HCPs总量或单个蛋白质,无法全面监测所有HCPs种类及其含量分布。10000ppm为弥补ELISA方法的局限性,液相色谱-串联质谱(
21、LC-MS/MS)逐渐成为一种高通量、1000 ppm高灵敏度检测HCPs残留的方法 9,通过液相色谱分离不同类型的HCPs和药物,并利用质100 ppm谱图与数据库对每种HCP进行确认和表征 12-13。LC-MS/MS法非特异性的特点避免了亲和力歧视问题,使定量结果更准确 14。此外,该方法还能在高丰度单克隆抗体(mAb)药物背10 ppm景下检测低至10 0.1 ppm的残留HCPs815-16,对于高风险型HCPs,通过建立靶向质谱分析方法可以有效识别并监控其清除情况,促进相196质谱学报第45卷临床前临床I期临床期临床期上市后原液中HCPs的原研和类似药的HCPs蛋白组差异分析HCP
22、s蛋白组分析分析工艺过程中持续存在的顽固HCPs,评估工艺放大过程对HCPs的影响,支持纯化工艺优化分析共洗脱HCPs图2 基于LC-MS/MS的HCPs检测方法在生物制品生命周期中的应用Fig.2Application of LC-MS/MS based HCPs measurement methods in life cycle management of biologics美国食品药品监督管理局批准了ActinobacBiomed公司仅使用LC-MS法进行HCPs质量控制的申请,该产品所用的细胞株目前尚未有商品化的HCP-ELISA试剂盒,这标志着LC-MS在HCPs 放行检测中的应用已
23、受到主流药品监管机构的认可。2 0 2 3年5月,美国药典发布了“质谱法测定生物药中残留宿主细胞蛋白”(征求意见稿)13,进一步推动和规范了LC-MS法在HCP分析检测中的应用。2生物质谱在生物制品宿主细胞残留分析中的工作流程HCPs的LC-MS/MS分析通常基于“自下而上”的蛋白质组学工作流程,包括样品预处理(可能包含HCPs富集或高丰度药物去除步骤)、酶切、LC-MS分析和数据处理 9,其工作流程示于图3。中间产物或成品被特异性蛋白酶消化后,经反相液相色谱(RPLC)分离并进入高分辨质谱仪进行肽段及其碎片离子的检测,通过数据库检索确定对应的HCPs序列,使用峰面积评估其含量。在开发HCPs
24、检测方法前,需要根据目标物以及样品特性设计研究方深度表征推进工艺优化准备锁定工艺高风险HCPs分析试剂表征:如ELISA试剂盒覆盖率分析案。如,高通量HCPs快速监测与低丰度HCPs高灵敏度分析采取的流程不同。对于ppm级的HCPs,在样品预处理过程中,常增加活性药物成分(API)去除或HCPs富集步骤,以降低高丰度API对低丰度 HCPs检测的干扰。2.1样品前处理根据目标分析物的差异,可以选择多种HCP样品制备和前处理策略。理论上,前处理步骤越简单,越能够无偏地反映样品中HCPs的实际情况。HCP分析常用的样品前处理方法列于表1,生物制品的API分子大小、性质、浓度和配方缓冲液等因素都会影
25、响样品制备和分离分析方法 13生物制品制剂处方中的表面活性剂、等渗调剂和氨基酸等可能影响样品的溶解性、酶切效率或形成干扰质谱检测的背景信号,可通过超滤、透析、有机溶剂沉淀等方式去除。但预处理可能导致一些HCPs信息丢失,例如,具有分子质量截留功能的脱盐柱或超滤管可能导致低分子质量HCPs的移除,需评估方法的回收率,将方法的优势和劣势控制在可接受的范围内。高风险HCPs靶向分析新型试剂分析API去除或HCPs富集(可选)酶切LC-MS图3LC-MS/MS法分析宿主细胞蛋白的典型流程Fig.3Typical workflow of LC-MS/MS based HCPs measurement第2
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