利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组SA11轮状病毒.pdf
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1、中 国 人 兽 共 患 病 学 报C h i n e s eJ o u r n a l o fZ o o n o s e s ,()D O I:/j i s s n 论著利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组S A 轮状病毒柴萨萨,蔡昊,刘夏飞,赵静,宋敬东,李金松,裴银辉,李利利,段招军国家重点研发计划(N o Y F C )通讯作者:李利利,E m a i l:l i l i l i c o m;O R C I D:作者单位:华北理工大学基础医学院河北省慢性疾病基础医学重点实验室,唐山 ;中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,国家卫生健康 委 员 会 医 学 病 毒 和 病 毒 病 重 点
2、 实 验 室,北 京 ;甘肃中医药大学公共卫生学院,兰州 摘要:目的利用反向遗传技术产生N S P 基因插入和表达外源基因的重组S A 轮状病毒,构建可表达外源基因的轮状病毒载体.方法本研究将轮状病毒S A 株的N S P 基因片段的 位(端)至 位的核苷酸删除,并直接插入连接了终止再启动元件(P A)的增强绿色荧光蛋白(E G F P)基因,采用已建立的“质粒”轮状病毒反向遗传系统拯救N S P 基因插入和表达E G F P的重组S A 轮状病毒.通过观察细胞病变效应和插入基因(E G F P)的荧光表达初步确定重组病毒的成功拯救,再结合电镜的形态学观察、R T P C R的测序结果及病毒基
3、因组的检测结果,进一步证明重组轮状病毒的成功拯救和传代扩增.利用T C I D 法和q R T P C R法,测定了r S A 和r S A /N S P E G F P的病毒滴度并绘制了基因组复制动力曲线.结果基于“质粒系统”成功拯救了重组轮状病毒r S A /N S P E G F P,证明N S P 片段截短并插入外源基因后病毒仍可正常复制,且具有良好的遗传稳定性,但病毒滴度低于其亲本株.结论基于N S P 基因插入和表达E G F P的重组轮状病毒能够实现稳定遗传,为利用反向遗传学构建表达外源基因的轮状病毒载体的深入探索提供了基础.关键词:A组轮状病毒;反向遗传;外源基因;N S P
4、基因中图分类号:R 文献标识码:A文章编号:()P r o d u c t i o no f r e c o m b i n a n tS A r o t a v i r u s e x p r e s s i n ge x o g e n o u s g e n e st h r o u g hr e v e r s eg e n e t i c t e c h n o l o g yCHA IS a s a,C A IH a o,L I UX i a f e i,Z HAOJ i n g,S ONGJ i n g d o n g,L I J i n s o n g,P E IY i n h
5、 u i,L IL i l i,DUANZ h a o j u n(C o l l e g eo fE l e m e n t a r yM e d i c i n e,N o r t hC h i n aU n i v e r s i t yo fS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,H e b e iK e yL a b o r a t o r yf o rC h r o n i cD i s e a s e s,T a n g s h a n ,C h i n a;K e yL a b o r a t o r yo fM e d i c a lV i
6、 r u s e sa n dV i r a lD i s e a s e s,N a t i o n a lH e a l t hC o mm i s s i o n,N a t i o n a lI n s t i t u t e f o rV i r a lD i s e a s eC o n t r o la n dP r e v e n t i o n,C h i n e s eC e n t e r f o rD i s e a s e sC o n t r o la n dP r e v e n t i o n,B e i j i n g ,C h i n a;S c h o o
7、 l o fP u b l i cH e a l t h,G a n s uU n i v e r s i t yo fC h i n e s eM e d i c i n e,L a n z h o u ,C h i n a)A b s t r a c t:I nr e c e n t y e a r s,a ne n t i r e l yp l a s m i d b a s e dr e v e r s eg e n e t i c s y s t e mf o r r o t a v i r u sh a sb e e ne s t a b l i s h e d T h e a d
8、 v a n t a g e so fu s i n gr e v e r s eg e n e t i c t e c h n o l o g yt om a n i p u l a t eg e n es e q u e n c e se n a b l e r o t a v i r u sg e n e s t ob ec a r r i e d i nv e c t o r s f o r e x p r e s s i o no f f o r e i g ng e n e s I nt h i s s t u d y,t h en u c l e o t i d e s f r
9、o mp o s i t i o n s (e n d s)t o o f t h eN S P g e n e f r a g m e n t o f t h e r o t a v i r u sS A s t r a i nw e r ed e l e t e d,a n da ne n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n(E G F P)g e n ec o n n e c t e dt oas t o pr e s t a r te l e m e n t(P A)w a sd i r e c t l y i
10、n s e r t e d T h e e s t a b l i s h e d p l a s m i dr o t a v i r u s r e v e r s e t r a n s m i s s i o ns y s t e mw a su s e d t or e s c u e t h e r e c o m b i n a n t v i r u sw h o s eN S P f r a g m e n tw a s r e p l a c e db y t h eN S P r e c o m b i n a n t f r a g m e n t T h e s u
11、c c e s s f u l r e s c u e o f t h e r e c o m b i n a n t v i r u sw a sd e t e r m i n e dp r e l i m i n a r i l yb yo b s e r v a t i o no fc y t o p a t h i ce f f e c t sa n dt h ef l u o r e s c e n c ee x p r e s s i o no ft h ei n s e r t e dE G F Pg e n e M o r p h o l o g i c a le l e c
12、t r o n m i c r o s c o p y o b s e r v a t i o n,R T P C Rs e q u e n c i n gr e s u l t sa n dv i r a lg e n o m ed e t e c t i o nr e s u l t st o g e t h e rv a l i d a t e d t h e s u c c e s s f u l r e s c u e a n dp a s s a g e a m p l i f i c a t i o no ft h er e c o m b i n a n tr o t a v
13、i r u s(r S A a n dr S A /N S P E G F P)T h ev i r a l t i t e r so fr S A a n dr S A /N S P E G F Pw e r em e a s u r e dw i t ht h eT C I D a n dq R T P C R m e t h o d s,a n dg e n o m er e p l i c a t i o nd y n a m i c sc u r v e sw e r ep l o t t e d T h ev i r a l t i t e ro f t h e t r u n c
14、 a t e dN S P f r a g m e n tw a s l o w e r t h a n t h a t o f i t sp a r e n t s t r a i n,b u tv i r a l r e p l i c a t i o nw a sn o ta f f e c t e d G e n o m ed e t e c t i o nr e s u l t s i n d i c a t e dt h a t t h e r e c o m b i n a n t v i r u s r S A /N S P E G F Ph a dg o o dg e n e
15、 t i cs t a b i l i t y T h i ss t u d yp r o v i d e sa f o u n d a t i o nf o r t h e i n d e p t he x p l o r a t i o no f t h e c o n s t r u c t i o no f r o t a v i r u sv e c t o r s f o r e x p r e s s i n g f o r e i g ng e n e s t h r o u g hr e v e r s eg e n e t i c s K e y w o r d s:G r
16、 o u pAR o t a v i r u s;r e v e r s eg e n e t i c s;f o r e i g ng e n e;N S P g e n eS u p p o r t e db yt h eN a t i o n a lK e yR e s e a r c ha n dD e v e l o p m e n tP r o g r a mo fC h i n a(N o Y F C )C o r r e s p o n d i n ga u t h o r:L iL i l i,Em a i l:l i l i l i c o mA组轮状病毒(r o t a
17、v i r u sA,R VA)是引起全世界婴幼儿急性重症胃肠炎和腹泻的主要病原体,每年相关的死亡病例达 多万例,其中多数发生在发展中国家,造成了巨大的社会经济负担 .R VA属于呼肠病毒目(R e o v i r a l e s)平滑呼肠病毒科(S e d o r e o v i r i d e a)轮状病毒属,是一种双链R NA病毒,其基因组包含 个节段,编码种结构蛋白(V P ,V P 和V P)和种非结构蛋白(N S P ).随着“反向遗传学”系统(r e v e r s eg e n e t i c ss y s t e m,R G S)的发展,研究者可在体外改造和拯救病毒,为基因功
18、能研究和病毒拯救提供了强大的平台.轮状病毒的反向遗传学系统最初于 年建立,其依靠辅助病毒的帮助,基于部分质粒实现了R VA基因片段的替换.之后经历 多年的不断探索,完全基于质粒的轮状病毒反向遗传系统在 年建立.近几年,利用反向遗传技术美国和日本报道多篇以轮状病毒作为载体表达外源蛋白的研究,这些研究主要以轮状病毒N S P 和N S P 片段为改造对象并插入外源基因.N S P 被认为是非必需病毒蛋白,具有拮抗干扰素的作用.且有研究发现,牛轮状病毒A 株的N S P 片段(b p)O R F区缺失 b p,只表达N端 个氨基酸,接种小鼠后仍能诱导腹泻.这为基于轮状病毒N S P 截短片段作为载体
19、表达外源基因提供思路.本研究将A组轮状病毒S A 株的N S P 片段 N端 至 的核苷酸截短(模拟牛A 株的缺失位点),并插入了终止再启动元件(P A)连接 的E G F P基 因,构 建 质 粒p T/S A N S P E G F P.采用已建立的“质粒”轮状病毒反向遗传系统成功拯救 具有良好 遗传稳 定 性 的 重 组 病 毒r S A /N S P E G F P.旨在为进一步开发基于轮状病毒载体的联合疫苗研究提供理论依据.材料与方法主要试剂DMEM培养基(G i b c o),胎牛血清(F B S)(G i b c o),胰蛋白示磷酸肉汤(T P B)(S i g m a),非必需
20、氨基酸溶液(N E AA)(G i b c o),L 谷氨酰胺(L G l u t a m i n e)(S i g m a),青链霉素(P S)(G i b c o),胰蛋白酶(含E D T A)(G i b c o),潮霉素(I n v i v o G e n),质粒D NA大 提 试 剂 盒(Q I AG E N),O p t i MEM(G i b c o),转染试剂T r a n sI TR L T(M i r u s b i o),猪九型胰蛋白酶(无E D T A)(S i g m a),核酸提取试剂盒(G e n e a i d),S D S P AG E凝胶制备试剂盒(S o
21、l a r b i o),快速银染试剂盒(碧云天生物技术),一步法R T P C R试剂盒(T h e r m oF i s h e r).细胞培养本研究使用的稳定表达T R NA聚合酶(T R NA P)的幼仓鼠肾细胞(B HK/T )由中国疾病预防控制中心腹泻室刘夏飞博士赠送,培养条件为 DMEM F B S T P BN E AAP SL G l u t a m i n e,每隔一代传代加潮霉素 g/m L以去除未表达T R NA P的细胞.非洲绿猴肾细胞(MA )由本实验室保存,培养条件为 DMEM F B SP S.培养环境均为,C O的细胞培养箱.质粒构建本研究使用的编码S A L
22、 基因组的 个T 拯救质粒和p C MV/N P R辅助质粒由中国疾病预防控制中心腹泻室刘夏飞博士赠送.根据文献报道构建截短N S P 片段中插入E G F P基因的质粒p T/N S P E G F P S A :将S A 毒株N S P 片段 端开始的第 位核苷酸删除,插入终止再启动元件(P A)连接的E G F P基因(b p),由苏州金唯智生物科技公司合成c D NA序列.合 成 的c D NA序 列 替 换 到 原p T/N S P S A 表达质粒的R s rI I和N c oI位点来构建p T/N S P E G F P S A 质粒.构建质粒的核苷酸序列经直接测序证实.转染所需
23、的 个质粒按照质粒大提试剂盒Q I AG E N E n d o F r e eP l a s m i d M a x iK i t说 明 书 提取,提取的质粒均经琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小符合超螺旋结构,并通过分光光度计测定其纯度和浓度,吸光度 /,每个质粒浓度均调整至m g/m L.B HK/T 细胞转染及病毒拯救采用“质粒系统”进行病毒拯救,具体步骤如下:期柴萨萨,等:利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组S A 轮状病毒B HK/T 细胞以/孔的密度铺于六孔板,培养 h至细胞汇合度达到 左右进行质粒转染.转染时,首先将 个质粒混合,包括g的p T/N S P S A 、p T/N S
24、P S A 、p T/N S P S A 、p T/V P S A 、p T/V P S A 、p T/V P S A 、p T/V P S A 、p T/V P S A 、p T/V P S A 、p CMV/N P R,和 g的p T/N S P S A 、p T/N S P S A ,当拯救重组病毒r S A /N S P E G F P时,将 质 粒p T/N S P S A 替 换 成p T/N S P E G F P S A .质粒混合物中加 L的O p t i MEM,用移液枪轻轻混匀,再加入 L的T r a n s I T L T 转染试剂,短暂涡旋混匀,置于室温下孵 育 m
25、i n.孵 育 结 束 后,均 匀 滴 入 六 孔 板B HK/T 细胞中,轻晃摇匀,置于C O培养箱继续培养.培养 h后,换不含胎牛血清的培养基,加重悬的MA 细胞/孔,h后每孔加胰蛋白酶至终浓度为g/m L,混合培养d将细胞冻融次后,g离心 m i n,上清保存于,传代接毒备用.拯救病毒传代培养将MA 细胞以/孔的密度接种于孔板,培养d.细胞汇合成单层 后,P B S清 洗 细 胞次,每 孔 加 m L的DMEM,放培养箱继续培养.随后取离心后的病毒上清 L,加胰蛋白酶(g/m L)、C a C l(g/m L)于 水浴锅活化病毒h,然后弃去孔板中DMEM,均匀滴入活化后的上清液.放入培养
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- 利用 反向 遗传 技术 产生 表达 基因 重组 SA11 轮状病毒
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