口服表达胸腺肽和鸡干扰素融合蛋白的重组乳酸乳球菌对鸡肠道菌群影响的研究.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 10 期2023 年 10 月Vol.45,No.10Oct.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202303011口服表达胸腺肽和鸡干扰素融合蛋白的重组乳酸乳球菌对鸡肠道菌群影响的研究刘增琪1,王贺1,2,胡洪娇1,2,崔子扬3,邱宇1,2,张素华1,崔红玉4*,王云峰1,2*,何高明1*(1.石河子大学 动物科技学院,新疆 石河子 832002;2.哈尔滨国生生物科技股份有限公司,黑龙江 哈尔滨 150028;3.河北北方大学 临
2、床医学院,河北 张家口 075000;4.中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所,黑龙江 哈尔滨 150069)摘要:为构建表达胸腺肽和鸡酌干扰素融合蛋白(T琢1-cIFN-酌)的重组乳酸乳球菌并检测其作为口服免疫增强剂对鸡外周血单个核细胞(PBMC)的增殖活性及鸡肠道菌群的影响,本研究将鸡胸腺肽(T琢1)和鸡干扰素(cIFN-酌)的编码基因序列(去除干扰素信号肽编码基因序列),并按照宿主菌乳酸乳球菌NZ3900株的基因组优化密码子后,以经G4S-linker连接的T琢1-cIFN-酌基因为模板,采用PCR扩增携带表达载体pNZ8149同源臂及HA标签的目的基因序列(T琢1-cIFN-酌-HA);通
3、过PCR扩增携带T琢1-cIFN-酌-HA基因序列同源臂的全长pNZ8149载体序列,利用同源重组的方式将这两段基因连接构建重组质粒pNZ8149-T琢1-cIFN-酌-HA,并经PCR和测序鉴定正确后电转化乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞中,构建重组乳酸乳球菌pNZ8149-T琢1-cIFN-酌-HA/NZ3900(r-T琢1-cIFN-酌)并经PCR和测序鉴定;将重组乳酸乳球菌r-T琢1-cIFN-酌经乳酸链球菌素(Nisin)诱导6 h7 h,离心超声破碎后取上清采用western blot鉴定T琢1-cIFN-酌的表达。结果显示,-T琢1-cIFN-酌经PCR扩增到3 185 bp的目
4、的基因片段,测序结果显示目的片段完全正确;且在约25 ku处出现特异性条带,与目的蛋白T琢1-cIFN-酌大小相符,利用BCA蛋白测定试剂盒构建标准曲线,对T琢1-cIFN-酌绝对定量显示其含量为31 滋g/mL。以重组乳酸乳球菌裂解液(含重组蛋白40 滋g/mL,重组菌2伊109cfu/mL)经口服免疫21日龄SPF鸡,并于28日龄加强免疫一次,于首免后2周、4周、7周采血分离PBMC,并分别采用ConA+Ionomycin、ConA+PMA及LPS刺激后,采用CCK-8法检测鸡PBMC的增殖活性。结果显示,经刺激后的各实验组鸡于首免后2周、4周、7周PBMC的增殖活性均极显著高于阴性对照组
5、(口服PBS的鸡)(0.001、0.0001、0.0001);7周后剖杀各组鸡取其盲肠粪便样品经PCR扩增16S rDNA基因的保守区V3V4基因序列,采用高通量测序并采用SIMCA软件、MOTHUR程序、AMDIS软件等对测序结果进行beta多样性、alpha多样性、菌群结构组成以及菌种重要性的LEfSe分析。beta及alpha多样性分析结果显示,实验组和阴性对照组鸡盲肠粪便样品测序结果分散于不同象限;且两组间样品的alpha多样性存在明显差异,表明实验组鸡具有更大的菌种丰度。菌群结构和组成分析结果显示,口服r-T琢1-cIFN-酌显著改变了鸡盲肠肠道菌群门水平和属水平的结构和组成,其中厚
6、壁菌门的乳酸杆菌属、普拉梭菌属和黏液真杆菌属等有益菌群显著增加;而拟杆菌门中的瘤胃菌属、另枝菌属等机会致病菌属显著减少。菌种重要性的LEfSe分析结果显示,与阴性对照组相比,口服r-T琢1-cIFN-酌对SPF鸡肠道菌群的组成有显著影响,来自杆菌纲、乳杆菌目、乳杆菌科、乳杆菌属和厚壁菌门等有益菌成为肠道菌群内的重要菌种。上述结果首次表明,口服r-T琢1-cIFN-酌不仅显著提高鸡PBMC的增殖活性等细胞免疫反应,而且还可以改善肠道菌群结构和组成,提高有益菌属的丰度,降低机会致病菌的丰度。本研究为天然绿色新型口服免疫增强剂和免疫佐剂的研制奠定了基础。关键词:胸腺肽;鸡干扰素;重组乳酸乳球菌;16
7、S rDNA;肠道菌群中图分类号:S852.4文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)10-1045-09收稿日期:2023-03-09基金项目:国家重点研发计划项目(2022YFD1800802、2023YFD1802600)作者简介:刘增琪(1998-),女,山东潍坊人,硕士研究生,主要从事益生菌免疫调节剂方向研究.*通信作者:E-mail:;*Corresponding authorStudy on the effect of oral administration of recombinantexpressing thymosin and chicken interfer
8、onfusion protein on chicken gut microbiotaLIU Zeng-qi1,WANG He1,2,HU Hong-jiao1,2,CUI Zi-yang3,QIU Yu1,2,ZHANG Su-hua1,CUI Hong-yu4*,WANG Yun-feng1,2*,HE Gao-ming1*(1.College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832002,China;2.Harbin Guosheng Biotechnology Co.,Ltd,Harbin 15002
9、8,China;3.Clinical College of Medicine,Northern University of Hebei,Zhangjiakou 075000,China;4.Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China)Abstract:In order to construct recombinantexpressing thymus peptide and chicken interferon-酌 fusion protein
10、(T琢1-cIFN-酌)and to detect its effect as an oral immune enhancer on the proliferative activity of chicken peripheral bloodmononuclear cells(PBMCs)and chicken intestinal microbiota.In this study,the coding gene sequences of chicken thymus peptide(T琢1)and chicken interferon-酌(cIFN-酌)with deletion of th
11、e signal peptide sequence were codon-optimized according to thegenome of the host strain,strain NZ3900.The T琢1-cIFN-酌 gene with a G4S-linker was used as the template toamplify the T琢1-cIFN-酌 gene by PCR.The target gene sequence(T琢1-cIFN-酌-HA)carrying the homology arm of pNZ8149 wasamplified by PCR.T
12、he pNZ8149 vector sequence carrying the homology arm of the T琢1-cIFN-酌-HA gene sequence was amplifiedby PCR,and the two segments of the gene were linked to construct a recombinant plasmid,pNZ8149-T琢1-cIFN-酌-HA,byhomologous recombination.The plasmid was identified correctly by PCR and sequencing afte
13、r electro-transformation ofNZ3900 receptor cells.The expression of T琢1-cIFN-酌 was detected by lactic acid streptococcin(Nisin)inducing for 6-7 hours,and the supernatant was taken after centrifugal ultrasonic crushing.The results showed that a specific bandappeared at 24ku,which was consistent with t
14、he size of the target T琢1-cIFN-酌 protein,and the standard curve was determined bythe BCA protein assay kit.The absolute quantification of the expression of T琢1-cIFN-酌 showed that its content was 31滋g/mL.21-week-old SPF chickens were immunized orally with recombinantlysate(containing 40滋g/mL of recom
15、binantprotein,2伊109cfu/mL)of recombinant lactis bacteria and boosted once at 28 weeks of age.PBMCs were separated from bloodcollection at 2 weeks,4 weeks,and 7 weeks after the first immunization.The proliferative activity of PBMCs in chickens wasdetected by the CCK-8 method after stimulation with Co
16、nA+Ionomycin,ConA+PMA,and LPS,respectively.The results showedthat the proliferative activity of PBMC in the experimental group was significantly higher than that in the negative control group(chickens with oral PBS)at 2 weeks,4 weeks,and 7 weeks after the first immunization after stimulation(0.001,0
17、.0001,0.0001).Seven weeks later,the cecal fecal samples of each group of chickens were dissected and amplified by PCR to amplifythe V3-V4 gene sequence in the conserved region of the 16S rDNA gene.Analysis of LEfSe for strain importance,beta diversity,alpha diversity,and microbiota structure was car
18、ried out by high-throughput sequencing and SIMCA software,MOTHUR program,and AMDIS software.The results of beta diversity and alpha diversity analysis showed that the sequencing results of chicken cecalfecal samples in the experimental and negative control groups were scattered in different quadrant
19、s,and significant differences inalpha diversity between the two groups,indicating that the experiment group of chickens had a greater abundance of strains.Theresults of microbiota structure and composition analysis showed that oral administration of r-T琢1-cIFN-酌 significantlychanged the structure an
20、d composition of intestinal microbiota in cecal feces,among which the beneficial microflora of,andinincreased significantly,while the opportunistic pathogens,suchasand the Rumen spp.,were reduced considerably.The LEfSe analysis of the importance of bacterial species showed thatoral r-T琢1-cIFN-酌 had
21、a significant effect on the composition of the intestinal microbiota of SPF chickens,and beneficialbacteria from,andbecame essential species in the intestinalmicrobiota.These results are the first to suggest that oral r-T琢1-cIFN-酌 not only significantly improves the proliferativeactivity and cellula
22、r immune responses of chicken PBMCs,but also improves the structure and composition of intestinal flora,中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1046胸腺肽琢1(Thymosin alpha1,T琢1)是一种由28个氨基酸组成的多肽类物质,1966年由美国科学家Goldstein等首次提取并分离。研究表明,T琢1具有稳定的结构和良好的生物活性,可以作为胸腺激素类的免疫调节剂1,并且T琢1无明显种属特异性,能够诱导各种动物的T细胞分化、发育和成熟,增强NK细胞功能,提高机体的免疫力2,同时
23、,T琢1也能激活机体固有免疫系统的效应细胞,包括外周血单个核细胞(PBMC)、树突状细胞(Dendritic cells,DC)和巨噬细胞,使机体的免疫抑制状态得到改善3。干扰素-酌(IFN-酌)也称为免疫干扰素,是一种由活化的自然杀伤细胞和T淋巴细胞产生的细胞因子,是先天免疫和适应性免疫反应的重要调节因子。IFN-酌也是一种有效的巨噬细胞激活细胞因子,可触发抗菌和抗原递呈功能,在宿主细胞防御病原中发挥关键作用,具有抑制病毒复制、抗肿瘤、抗寄生虫及免疫调节等作用4。已有研究表明,IFN与胸腺肽具有协调互补作用并能促进T细胞的生长、增殖、分化和激活NK细胞活性等功能,可增强机体的免疫功能,二者的
24、联合应用优于单独使用,具有更强的抗病毒功效5。当前,兽医临床缺乏高效安全、廉价的免疫佐剂和抗病毒生物制剂,因此干扰素和胸腺肽联合应用作为一种重要的免疫增强剂和抗病毒制剂,在病毒性疾病的预防、免疫治疗及疫苗佐剂方面具有很好的应用前景。乳酸菌多为肠道益生菌,具有促进肠胃蠕动、维持肠道菌群结构平衡、增强机体免疫力的功效6。家禽的肠道存在复杂且动态的微生物群落,例如细菌、真菌、古细菌/古生菌以及病毒等。一旦打破这些微生物种群的平衡,就会使家禽的肠道菌群发生紊乱从而引发各种肠道方面的疾病,甚至对其健康状况产生极大的危害7-8。Sanders等研究发现益生菌可以减少肠道菌群变化的范围或促进失调的肠道菌群快
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