牛磺熊去氧胆酸通过调节内质网应激抑制转化生长因子β1所诱导的心肌成纤维细胞纤维化.pdf
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1、基础研究牛磺熊去氧胆酸通过调节内质网应激抑制转化生长因子 1所诱导的心肌成纤维细胞纤维化张含林 林辉 郭航远312000 绍兴市人民医院(浙江大学绍兴医院)心内科通信作者:郭航远,电子信箱:guohangyuan DOI:10.3969/j.issn.1007-5410.2024.01.011 【摘要】目的 探讨牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)对转化生长因子 1(TGF-1)所诱导的心肌成纤维细胞(CFs)活化的作用及相关机制,为 TUDCA 治疗糖尿病心肌纤维化提供新的治疗目标。方法 提取原代 SD 乳鼠 CFs 和心肌细胞,通过免疫荧光法鉴定 CFs 的纯度。分别将高糖培养下的 CFs用不同时
2、间的 TGF-1 干预,用 Western blot 检测内质网应激(ERS)通路相关蛋白和纤维化指标的表达,探讨 TGF-1 对 CFs 活化及 ERS 相关通路的影响。用 Western blot 检测 CFs 和心肌细胞内同型半胱氨酸内质网应激泛素样结构域 1(Herpud1)的表达情况。通过沉默 Herpud1 的表达及用 Transwell和 Western blot 检测沉默 Herpud1 后 CFs 纤维化指标的表达,探讨 Herpud1 在 TGF-1 诱导的 CFs 活化中的作用。用 CCK-8 检测不同浓度的 TUDCA 处理下 CFs 的活力。用免疫荧光和 Wester
3、n blot 检测TUDCA 对 TGF-1 诱导的 CFs 中 Herpud1、葡萄糖调节蛋白 78(GRP78)、转录激活因子 6(ATF6)、-平滑肌肌动蛋白(-SMA)、波形蛋白(Vimentin)和型胶原蛋白(Collagen)表达的影响。为进一步明确 Herpud1 在 TUDCA 抑制 CFs 活化中的作用,用 Western blot 检测过表达 Herpud1 后相关蛋白的表达情况。结果在成功构建 CFs 纤维化模型的基础上,TGF-1 能够诱导 CFs 活化及 ERS 通路相关蛋白的表达;Herpud1 在 CFs 中的表达高于心肌细胞;敲除 Herpud1 可抑制 TGF
4、-1 所诱导的 CFs 活化;TUDCA 能显著降低 TGF-1 诱导的 CFs 中 GRP78、ATF6、-SMA、Vimentin 和 Collagen的表达水平;此外,过表达 Herpud1 还可逆转 TUDCA 对 TGF-1 诱导的 CFs 活化的抑制。结论下调Herpud1 基因的表达是 TUDCA 抑制 TGF-1 诱导的 CFs 纤维化的机制之一。【关键词】心肌成纤维细胞;Herpud1;牛磺熊去氧胆酸;转化生长因子 1;纤维化基金项 目:国 家 自 然 科 学 基 金 青 年 项 目(82200390);绍 兴 市 级 医 卫 类 科 技 计 划 项 目(2020A13015
5、)Tauroursodeoxycholic acid through modulating endoplasmic reticulum stress on inhibition of transforming growth factor 1-induced fibrosis in cardiac fibroblasts Zhang Hanlin,Lin Hui,Guo HangyuanDepartment of Cardiology,Shaoxing People s Hospital,Zhejiang University Shaoxing Hospital,Shaoxing 312000,
6、ChinaCorresponding author:Guo Hangyuan,Email:guohangyuan 【Abstract】Objective To investigate the effect of taurodeoxycholic acid(TUDCA)on the activation of cardiac fibroblasts(CFs)induced by transforming growth factor 1(TGF-1)and its related mechanisms,and to identify a new therapeutic target for TUD
7、CA in the treatment of diabetic myocardial fibrosis.MethodsThe CFs and cardiomyocytes of primary neonatal SD rats were extracted,and the purity of CFs was identified by immunofluorescence.CFs cultured with high glucose were treated with TGF-1 for different duration.The expression of endoplasmic reti
8、culum stress(ERS)pathway related proteins and fibrosis markers were detected by Western blot to explore the effect of TGF-1 on CFs activation and ERS related pathway.Western blot was used to detect the expression of homocysteine-inducible,ERS-inducible,ubiquitin-like domain member 1(Herpud1)in CFs a
9、nd cardiomyocytes.The role of Herpud1 in TGF-1-induced CFs activation was explored by silencing the expression of Herpud1 and detecting the expression of CFs fibrosis markers after silencing Herpud1 by Transwell and Western blot.CCK-8 was used 65中国心血管杂志 2024 年 2 月第 29 卷第 1 期 Chin J Cardiovasc Med,Fe
10、bruary 2024,Vol.29,No.1to detect the activity of CFs treated with different concentrations of TUDCA.Immunofluorescence and Western blot were used to detect the effects of TUDCA on the expression of Herpud1,glucose regulated protein 78(GRP78),transcriptional activator 6(ATF6),-smooth muscle actin(-SM
11、A),vimentin(Vimentin)and type collagen(Collagen)in CFs induced by TGF-1.In order to further clarify the role of Herpud1 in the inhibition of CFs activation by TUDCA,the expression of related proteins after reaching Herpud1 was detected by Western blot.ResultsBased on the successful construction of a
12、 fibrosis model of CFs,TGF-1 was proved to induce CFs activation as well as the expression of ERS pathway-related proteins.Expression of Herpud1 was higher in CFs than in cardiomyocytes.Knockdown of Herpud1 showed inhibition of CFs activation induced by TGF-1.TUDCA significantly reduced TGF-1-induce
13、d activation of CFs in GRP78,ATF6,-SMA,Vimentin and Collagen expression levels.In addition,overexpression of Herpud1 reversed the inhibition of TGF-1-induced activation of CFs by TUDCA.ConclusionsDown-regulation of Herpud1 gene expression is one of the mechanisms by which TUDCA inhibits TGF-1-induce
14、d cellular fibrosis in CFs.【Key words】Cardiac fibroblasts;Herpud1;Tauroursodeoxycholic acid;Transforming growth factor beta 1;FibrosisFund program:National Natural Science Foundation Youth Project(82200390);Shaoxing Municipal Medical and Health Science and Technology Program(2020A13015)国际糖尿病联合会预测,到
15、2040 年,糖尿病的患病率将达 10.4%(6.42 亿)。糖尿病的主要并发症之一是糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)1。DCM 的特征是代谢紊乱,通常伴有局部炎症、氧化应激、心肌纤维化和心肌细胞凋亡2。在心肌纤维化过程中,细胞外基质主要来源于心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)3。转化生长因子 1(transforming growth factor beta 1,TGF-1)被认为是诱导 CFs 向肌成纤维细胞转化的最强的促纤维化细胞因子4。DCM 中,高糖等因素可活化TGF-1,从而促进 CFs 活化,表现为表达收缩蛋白
16、,如-平滑肌肌动蛋白(-smooth muscle actin,-SMA)的表达增加,并合成大量的细胞外基质,包括波形蛋白(Vimentin)和 型胶原蛋白(Collagen)5-6。目前研究认为,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在 DCM 发病和进展中起着关键作用7。同型半胱氨酸内质网应激泛素样结构域 1(homocysteine-inducible,endoplasmic reticulum stress-inducible,ubiquitin-like domain member 1,Herpud1)是一种广泛表达于内质网膜上的蛋白。Herp
17、ud1 已被报道与糖尿病和阿尔茨海默病等多种疾病有关7。我们前期研究发现,Herpud1 介导的ERS 在动脉粥样硬化和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)可塑性中起重要作用8,敲除 Herpud1 可保护血管紧张素诱导的内皮细胞凋亡9。牛 磺 熊 去 氧 胆 酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)是公认的 ERS 抑制剂10。有研究发现,TUDCA 可减轻压力负荷引起的心功能障碍11,并通过抑制 ERS 减少糖尿病小鼠心肌缺血再灌注后巨噬细胞和中性粒细胞的浸润,从而减少心肌细胞凋亡和炎症反应12。我们推测,TUDCA
18、 通过Herpud1 介导的 ERS 通路可抑制 CFs 活化。但TUDCA 对 DCM 的缓解作用及其可能机制仍需要进一步验证。本研究旨在通过 TUDCA 干预 TGF-1诱导的 CFs,比较药物干预前后 CFs 的活化情况,为临床应用 TUDCA 治疗 DCM 提供实验依据,并阐明Herpud1 基因在 TGF-1 诱导的 CFs 活化中的关键作用。1 材料与方法1.1 实验动物和主要试剂6 周龄的 SPF 级 SD 大鼠,均自南京大学模式动物研究所购得。根据国家卫生研究院实验动物关爱使用指南,所有动物方案均经绍兴市人民医院动物关爱利用委员会批准。所有动物实验均在绍兴市人民医院实验动物中心
19、完成,动物使用许可证号:SYXK(浙)2017-0007,SPF 级 环 境,湿 度 为40%60%,室温为 2228,昼夜交替循环时间为12 h。食物和水自由供应。TUDCA、链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)和嘌呤霉素均为美国 MCE 公司产品。高糖 DMEM 培养基、0.25%胰蛋白酶、链霉素-青霉素混合液、Lipofectamine 3000、Opti-MEM培养基及胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均为美国 Gibco 公司产品。TGF-1 和型胶原酶为美国Cell signaling 公 司 产 品。葡 萄 糖 调 节 蛋 白 78(gluco
20、se regulated protein 78,GRP78)、转录激活因子 6(activating transcription factor 6,ATF6)、-SMA、Vimentin、Herpud1、Collagan、Anti-beta Actin 和Troponin T 抗体均为美国 Abcam 公司产品。5-Brdu为美国 Sigma 公司产品。异硫氰酸荧光素标记的山75中国心血管杂志 2024 年 2 月第 29 卷第 1 期 Chin J Cardiovasc Med,February 2024,Vol.29,No.1羊抗兔 IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG和 West
21、ern blot 相关试剂均为江苏碧云天生物技术有限公司产品。siHerpud1、Control 组的病毒和转染的 P 液为上海吉凯生物公司产品。对照质粒以及Herpud1 过表达质粒为上海和元生物公司产品。HE染色、马松染色以及免疫组织化学试剂盒均为北京索莱宝公司产品。Transwell 小室为美国 Corning 公司产品。1.2 模型构建和实验分组为确定 TGF-1 对 ERS 通路相关因子及纤维化相关因子的影响,用 TGF-1 诱导高糖培养下的CFs,采用随机数字表法将 CFs 分为 Control 组、6 h、12 h 和 24 h 组。为确定 Herpud1 在心脏中的表达,分别提
22、取原代心肌细胞和 CFs 进行下一步的研究。为检测 TUDCA 对 CFs 活性的影响,将高糖培养下的 CFs 用不同浓度(0、1、10、100、1 000 和 10 000 M,1 d)TUDCA 干预。为明确 TUDCA 对 TGF-1诱导的 CFs 活化及 ERS 通路相关蛋白的影响,采用随机数字表法将高糖培养下的 CFs 分为 HG(25 mmol/L 葡萄糖)组、TGF-1(10 ng/ml)组,TGF-1+TUDCA 100(100 M)组、TGF-1+TUDCA 1 000(1 000M)组。为验证 Herpud1 对 CFs 的敲除效率,采 用 随 机 数 字 表 法 将 CF
23、s 分 为 NC、siNC、siRNA1、siRNA2 和 siRNA3 组。为 了 明 确 敲 除Herpud1 对 CFs 的激活、增殖和迁移的影响,选择敲除效率最高的 Herpud1 siRNA1 进行下一步研究,采用随机数字表法将 CFs 分为 HG+siNC、TGF-1+siNC、HG+siHerpud1、TGF-1+siHerpud1 组。为了验证 Herpud1 在 TUDCA 抑制 CFs 纤维化中的作用,将高糖培养下的 CFs 分为 TGF-1、TUDCA(TGF-1+TUDCA)、TUDCA+oeVec(TGF-1+TUDCA+oeVec)、TUDCA+oeHerpud1(
24、TGF-1+TUDCA+oeHerpud1)组。1.3 CFs 和心肌细胞的分离培养自行繁育的 37 d SD 乳鼠用体积分数为 70%的乙醇消毒,腹腔麻醉后颈椎脱臼法处死,在无菌条件下剪开胸骨,立即取出心脏置于含有肝素钠的冷 D-Hanks 溶液中,显微镜下去除残留的大血管和筋膜,缓冲液反复漂洗去除血液,用眼科剪剪成1.52.0 mm3的组织块,用 D-Hanks 液仔细漂洗。组织块转移至15 ml 离心管中,加入3 g/L 的型胶原酶 6 ml,37下置于水平摇床上摇动 90 min,取上清液立即加入 6 ml 含体积分数 10%FBS 的 DMEM培养基终止胶原酶反应,1 500 r/m
25、in 离心 5 min,再悬浮在含有 10%FBS、100 IU/ml 青霉素和 100 g/ml链霉素的 DMEM(高糖)中。然后,采用差速贴壁法分离 CFs,在 37培育 90 min 后,收集上清液,贴壁细胞就是小鼠心肌细胞(mCF),将上清液转移到新的培养皿中,同时加入 5-Brdu(B5002,sigma)抑制CFs 的生长,24 h 后,显微镜下可见跳动的小鼠心肌细胞(mCM)。观察细胞生长情况,细胞达 80%90%融合时传代,即为原代培养的第一代,第二代至第三代 CFs 被用于实验。1.4 细胞免疫荧光法鉴定 CFs采用细胞免疫荧光法鉴定 CFs 的纯度,鉴定标准为 Viment
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