楸树DELLA基因家族生信分析及CbuGRAS9的功能分析.pdf

植物研究 2024，44（1）：139 151Bulletin of Botanical Research楸树DELLA基因家族生信分析及CbuGRAS9的功能分析王珊珊1 王瑞1 樊二勤1 付鹏跃1 曲冠证1 王楠2*（1.林木遗传育种全国重点实验室，东北林业大学，哈尔滨 150040；2.中国林业科学研究院，北京 100091）摘 要 通过鉴定楸树（Catalpa bungei）DELLA家族基因并分析CbuGRAS9的基因功能，为楸树生殖调控性状的遗传改良提供理论依据。基于楸树基因组数据，鉴定并克隆了 5 个与拟南芥（Arabidopsis thaliana）同源的CbuDELLAs基因；利用ExPASy、SWISS-MODEL、Plant-mPloc、PlantCare等在线工具对CbuDELLAs蛋白进行等电点、蛋白结构、亚细胞定位及启动子顺式作用元件预测；以9-1（Catalpa bungei Luoqiu No.1）和 百日花 楸树（Catalpa Bairihua）为材料，分析了CbuDELLAs基因的表达量差异，并通过异源转化拟南芥证实了CbuGRAS9的分子功能，利用酵母双杂交文库筛选了与CbuGRAS9互作的蛋白。结果表明：5个CbuDELLAs蛋白的氨基酸数目为 455588，蛋白相对分子质量为 5.046.43 kDa，等电点为 4.815.14；CbuDELLAs 蛋白均含有 DELLA 和GRAS保守结构域，全部为亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果显示CbuDELLAs蛋白均定位于细胞核中。启动子顺式作用元件分析发现，这5个DELLAs基因启动子区均含有参与赤霉素反应的顺式作用元件。qRT-PCR结果显示，百日花 楸中CbuDELLAs基因表达量显著高于对照9-1楸，其中CbuGRAS9为差异最显著的基因，CbuGRAS9转基因株系的开花时间被明显推迟。鉴定到与CbuGRAS9互作的蛋白质主要富集在核糖体、氨基酸合成、次级代谢、光合作用、TCA循环等代谢通路。关键词 楸树；DELLAs；生物信息学分析；功能分析；互作蛋白中图分类号：Q949.777.9 文献标志码：A doi：10.7525/j.issn.1673-5102.2024.01.016Bioinformatics Analysis of CbuDELLAs Gene Family and Functional Analysis of CbuGRAS9WANG Shanshan1 WANG Rui1 FAN Erqin1 FU Pengyue1 QU Guanzheng1 WANG Nan2*（1.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry University，Harbin 150040；2.Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091）Abstract To provide theoretical basis for genetic improvement of reproductive regulatory traits of Catalpa bungei，DELLAs family genes were identified and the function of CbuGRAS9 was analyzed.Based on the genomic data of Catalpa bungei，five CbuDELLAs genes homologous to Arabidopsis thaliana were identified and cloned.ExPASy，SWISS-MODEL，Plant-mPloc，PlantCare and other online tools were used to predict the isoelectric point，protein structure，sub-cellular localization and promoter cis-acting elements of CbuDELLAs protein.The expression differences of CbuDELLAs were analyzed by using Catalpa Bairihua and Catalpa bungei Luoqiu No.1 as materials，and the molecular function of CbuGRAS9 was confirmed by heterologus transformation in Arabidopsis thaliana，and the proteins interacted with CbuGRAS9 were screened by yeast two-hybrid library.The results showed that the amino acid number of the five CbuDELLAs proteins ranged from 455 to 588 aa，the relative molecular weight of the proteins ranged from 5.04 to 6.43 kDa，and the isoelectric point value ranged from 4.81 to 5.14.All CbuDELLAs proteins contained DELLA and GRAS conserved domains and are hydrophilic proteins.Sub-cellular localization prediction showed that CbuDELLAs protein was located in the nucleus.The analysis of promoter cis-acting elements showed that the five promoter regions of DELLAs all 基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFD2200202）。第一作者简介：王珊珊（1997），女，硕士研究生，主要从事林木遗传育种研究。*通信作者：E-mail：。收稿日期：2023年05月12日。44 卷植物研究contained cis-acting elements involved in gibberellin reaction.The results of qRT-PCR showed that the expression of CbuDELLAs in Catalpa Bairihua were significantly higher than that in Catalpa bungei Luoqiu No.1，and CbuGRAS9 was the most significantly gene，and the flowering time of CbuGRAS9 transgenic plants were significantly delayed.Proteins interacted with CbuGRAS9 were mainly concentrated in metabolic pathways such as ribosome，amino acid synthesis，secondary metabolism，photosynthesis and TCA cycle.Key words Catalpa bungei；DELLAs；bioinformatics analysis；function analysis；interacting proteins成花转变是植物从营养生长到生殖生长的关键发育过程，该过程受到遗传和环境等诸多因子调控1-2。学者们基于模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）揭示了许多植物成花诱导的分子机制1，3。植物开花由多条内外信号途径调控，主要遗传途径包括光周期途径、春化途径、自主途径、赤霉素途径、温度以及年龄途径4-5。这些途径通过激活成花调控因子FT、SOC1以及LFY等促进开花，而ELF3、SVP、TEM1和TEM2等因子能抑制开花基因的表达6。赤霉素（GAs）途径被认为是调控开花的主要途径之一，当赤霉素受体感知GA信号后，通过调控相关开花基因（如 FT、FLC、SOC1及LFY）的表达进而影响植物开花7-9。生长抑制因子 DELLA蛋白是 GA信号转导的关键成分，目前许多研究已经证实 DELLA 蛋白的多个保守结构域在GAs信号通路中发挥调控作用10。DELLA蛋白C端的GRAS结构域高度保守，可以通过参与蛋白间的互作和转录调控过程抑制GAs信号，同时对于维持 DELLA 蛋白的功能也发挥了至关重要的作用11。DELLA 蛋白的 N 端是不高度保守的，其N端调控区所包含的DELLA和TVHYNP序列作为GA信号的感知结构域，对GID1结合至关重要，是 GAs 诱导 DELLA 蛋白降解的结构基础12-13。GAs存在或者浓度增加的情况下，GAs与GID1受体结合促进GID1-GA-DELLA复合物的形成，然后经过SCFSLY1E3泛素酶介导靶向DELLA蛋白泛素化，最后致使DELLA蛋白在26S蛋白酶体中的最终降解14-17。有相关研究表明，DELLA调控植物生长可通过不依赖于GA的方式进行18，如发生琥珀酰化的DELLA能够通过SIM-SUMO结构域与GID1相互作用，随后DELLA蛋白的泛素化降解被诱导19-21。尽管已有研究表明DELLA蛋白可能在生殖调控中发挥重要作用，但是不同物种中DELLAs蛋白数目差异及功能分化还有待进一步研究22。对于多年生木本植物而言，开花对其发育以及经济价值的提高至关重要。适宜的开花时间作为木本关键性状之一，很大程度上影响木本植物的品质23。楸树（Catalpa bungei）是紫葳科（Bignoniaceae）梓属（Catalpa）多年生木本植物，作为我国特有的珍贵树种和观赏树种，广泛分布在河南、安徽等地24 。百日花 楸树（Catalpa Bairihua）的获得是以 F1代楸树为母本，滇楸（C.fargesii f.duclouxii）为父本，经过人工控制杂交获得的F2代杂种25。楸树一般在种植57年后首次开花，而 百日花 楸树作为一个新品种，嫁接当年就能开花，且花期要远长于普通楸树，每年累积花期可达100 d，这在木本植物中很少发生23，26-27。因此，百日花楸树可作为木本植物中研究生殖转变相关调控机制的重要材料。本研究从楸树基因组中共鉴定到5个DELLAs基因，分析了其在 百日花 和对照9-1（Catalpa bungei Luoqiu No.1）中的表达量差异，明确了差异最显著的基因CbuGRAS9的分子功能，筛选了与CbuGRAS9互作的蛋白。本研究不仅有助于进一步解析 百日花 楸提早开花的分子机制，也将为其他木本植物生殖调控研究提供理论参考。1 材料与方法1.1试验材料试验材料是2022年5月在河南省南阳市采集的1年生嫁接苗9-1楸（对照）和 百日花 楸，砧木为1年生梓树（C.ovata）。试验中所用到的拟南芥（Arabidopsis thaliana Col-0）和烟草（Nicotiana benthamiana）均由林木遗传育种全国重点实验室提供。1.2CbuDELLAs蛋白基本信息学分析使用利用 ExPASy（https：/web.expasy.org）网站在线预测CbuDELLAs蛋白的氨基酸数目、等电点和分子质量；利用 Plant-mPloc（http：/ 线 工 具 对 CbuDELLAs 的蛋白进行亚细胞定位预测；通过 SOPMA（https：/npsa-prabi.ibcp.fr）和SWISS-MODEL（https：/swissmodel.expasy.org/interactive）在线工具对其进行140王珊珊等：楸树DELLA基因家族生信分析及CbuGRAS9的功能分析1 期蛋白质二级结构和三级结构预测；通过 TMHMM（https：/services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）和 SignalP-5.0（https：/services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）在线工具对其跨膜结构域和信号肽进行分析。使用 EMBL-EBI（http：/pfam.xfam.org/+TBtools）在线工具对楸树的氨基酸序列进行保守结构域的分析鉴定；使用MEME（https：/meme-suite.org/meme/meme_5.3.2/tools/meme）网站对楸树 CbuDELLAs 蛋白的保守基序进行在线分析，motifs 数目设置为 1228。根据已知楸树基因组序列，提取转录起始位置（ATG）前 2 000 bp 序列作为启动子序列，通过PlantCare在线网站对基因启动子顺式作用元件进行预测。1.3楸树CbuDELLAs基因克隆从楸树基因组中提取CbuGRAS1、CbuGRAS2、CbuGRAS9、CbuGRAS22 和 CbuGRAS32 的 基 因 序列。利用植物总RNA提取试剂盒（北京兆葵生物科技有限公司）提取 9-1楸和 百日花 楸不同组织部位的总RNA，包括顶芽、幼叶、功能叶、茎、木质部、韧皮部以及 百日花 楸树的花，提取详细方法 参 照 试 剂 盒 说 明 书。使 用 TaKaRa 公 司 的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒将总RNA反转录合成cDNA。利用Bioedit软件进行引物设计，以cDNA为模板，使用特异性引物扩增目的片段，所用引物见本刊网站电子附表1。反应体系与程序参考东洋纺（上海）生物科技有限公司的 KOD-Plus-Neo说明书。PCR产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用胶回收试剂盒对目的条带单一的胶块进行胶回收。回收得到的 DNA片段与 pEASY-T1 进行 DNA 连接，连接产物通过热激法转入大肠杆菌感受态，涂布于具有Kan抗性的LB平板上，37 倒置培养1618 h。随机在抗性平板上挑取单克隆菌斑进行PCR检测，检测正确的单克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。1.4楸树CbuDELLAs组织特异性表达分析利用 Instegrated DNA Technologies 在线网站进 行 定 量 引 物 设 计，以 CbuActin（evm.model.group3.531）为内参基因，以无性系9-1楸和 百日花楸不同组织部位的cDNA为模板进行qRT-PCR检测分析。定量PCR检测所需引物见附表1，实时荧光定量PCR体系参考TB GreenTM Premix Ex TaqTM 试剂说明书。使用2CT法分析数据，分析CbuDELLAs在9-1楸和 百日花 楸不同组织的相对表达量。1.5CbuGRAS9基因异源转化及表型分析将目的片段 CbuGRAS9 与过表达载体 pROK 连 接 并 转 入 GV3101 农 杆 菌（Agrobacterium Strain），使用花序侵染法转化拟南芥。对转基因拟南芥进行表型观察分析。1.6农杆菌介导烟草叶片瞬时转化及亚细胞定位观察构建 pGWB405-35S：CbuGRAS9-GFP 质粒转化至GV3101农杆菌菌种中，使用注射法29对小叶烟草叶片瞬时转化，黑暗室温条件下培养48 h；取注射后叶片在激光共聚焦显微镜下观察亚细胞定位试验结果。1.7CbuGRAS9蛋白转录激活活性分析及酵母双杂交文库筛选将 CbuGRAS9 基因构建到 pGBKT7 载体，在SD/-Trp/-Leu 液 体 培 养 基 中 分 别 加 入 Y2HGold（pGBKT7-CbuGRAS9）、阳性对照、阴性对照和毒性对照于恒温条件下培养；菌液分别稀释100、1 000、10 000 倍。菌 液 点 样 至 SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His（QDO）培养基，于恒温培养箱中培养72 h，观察转录自激活活性。挑取诱饵载体的单菌落加入 SD/-Trp液体培养基活化，活化菌液划线培养。单菌落过夜培养至OD600到达0.8。将酵母菌液加入液体培养基重悬细胞。将楸树酵母文库工作菌液与重悬的菌液一同加入液体培养基，在恒温振荡培养箱中培养；20 h后，40倍光学显微镜下观察杂交样品中是否出现三叶草形状的结合子。将培养后的菌液离心后再次用液体培养基重悬菌体，重复2次；取部分菌液梯度稀释100、1 000、10 000倍，分别将原液与稀释菌液涂在平板上培养。观察培养基上的白色菌落，随机挑取单菌落进行 PCR检测23。1.8高通量测序及GO富集和KEGG富集分析将酵母双杂交筛选的所有菌落混合后进行纯化回收送至深圳华大基因股份有限公司进行高通量测序。测序结果利用cutadapt2.630去除引物序列，将去除引物后的 reads 利用 bowtie2.3.5.128比对到参考基因组。比对到各个基因的测序 reads count使用bedtools v2.29.031进行提取，将count0的基因进行GO富集分析和KEGG富集。GO分析标注目的基因并且注释分类；通过目的基因的分14144 卷植物研究布情况，判断目的基因相关功能。将目的基因与KEGG数据库比对，标记目的基因的分布及富集情况及显著相关的信号通路32。2 结果与分析2.1CbuDELLAs蛋白基本信息学提取拟南芥中的AtDELLAs蛋白序列并在楸树基因组中BLAST，鉴定到5个同源蛋白。将5个CbuDELLAs蛋白根据拟南芥数据库中蛋白质注释分别命名为 CbuGRAS1、CbuGRAS2、CbuGRAS9、CbuGRAS22 和 CbuGRAS32，均属于 GRAS 家族，DELLA亚家族。如表1所示，全部蛋白的氨基酸数目455588，相对分子质量5.046.43 kDa，等电点 4.815.14。亚细胞定位的预测结果显示，5 个CbuDELLAs 蛋白均定位于细胞核中。除了 CbuGRAS22不稳定系数小于 40之外，其他几个蛋白不稳定系数都大于40，表明仅CbuGRAS22是稳定蛋白，其余为不稳定蛋白。根据预测结果显示，CbuDELLAs蛋白亲水性平均系数-0.246-0.174，全部为亲水性蛋白。2.2CbuDELLAs蛋白二级与三级结构将 CbuDELLAs 蛋白进行二级结构预测，5个蛋白二级结构中螺旋所占比例最多，在50%左右；其次是无规则卷曲，占比28.57%40.82%；转角和延伸链占比分别为 4.40%5.64%和 8.90%10.55%；因此CbuDELLAs蛋白的主要组成成分是螺旋和无规则卷曲（图1，表2）。蛋白三级结构预测结果如图 2所示，CbuGRAS1、CbuGRAS32和CbuGRAS9 都由 15 个 螺旋和 9 个 折叠组成，CbuGRAS2 由 14 个 螺旋和 11 个 折叠组成，CbuGRAS22由 14个 螺旋和 9个 折叠组成，表明 CbuGRAS1、CbuGRAS32 和 CbuGRAS9 的三级结构特征相似，与其他两个有所不同。2.3CbuDELLAs保守结构域与保守基序CbuDELLAs蛋白均包含C端的GRAS保守结构域和 N 端的 DELLA 结构域（见图 3）。使用MEME在线工具对楸树DELLAs蛋白的保守基序分析，motifs数量设置为12；CbuGRAS2缺少motif 8和motif 12，而CbuGRAS1、CbuGRAS9、CbuGRAS22和CbuGRAS32的12个保守基序相同且位置基本一致。由此表明 CbuGRAS22、CbuGRAS1、CbuGRAS9 和 CbuGRAS32 有较高的相似性，而 CbuGRAS2与其他蛋白存在差异性。表1CbuDELLAs蛋白的基本信息Table 1Basic information of CbuDELLAs拟南芥蛋白名称Protein names in Arabidopsis thalianaAtGAI（AT1G14920）AtRGA1（AT2G01570）AtRGL2（AT3G03450）AtGAI（AT1G14920）AtRGA1（AT2G01570）楸树蛋白名称Protein names in Catalpa bungeiCbuGRAS22CbuGRAS1CbuGRAS9CbuGRAS2CbuGRAS32编码区长度Encoding length/bp17551767166213681755氨基酸数目Amino acid number585588553455584等电点Isoelectric point4.814.994.935.145.08相对分子质量Molecular weight/kDa6.416.436.015.046.40亚细胞定位Sub-cellular localization细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus细胞核Nucleus表2CbuDELLAs蛋白的二级结构分析Table 2Secondary structure analysis of CbuDELLAs楸树蛋白名称Protein names in Arabidopsis thalianaCbuGRAS1CbuGRAS2CbuGRAS9CbuGRAS22CbuGRAS32螺旋-helix数量Number265257273269269比例Percent/%45.0756.4849.3745.9846.06转角-sheet数量Number2820263328比例Percent/%4.764.404.705.644.79无规则卷曲Random coil数量Number240130197228235比例Percent/%40.8228.5735.6238.9740.24延伸链Extended strand数量Number5548575552比例Percent/%9.3510.5510.319.408.90142王珊珊等：楸树DELLA基因家族生信分析及CbuGRAS9的功能分析1 期图1CbuDELLAs蛋白二级结构预测A.CbuGRAS1蛋白二级结构；B.CbuGRAS2蛋白二级结构；C.CbuGRAS9蛋白二级结构；D.CbuGRAS22蛋白二级结构；E.CbuGRAS32蛋白二级结构。Fig.1Secondary structure prediction of CbuDELLAsA.CbuGRAS1 secondary structure；B.CbuGRAS2 secondary structure；C.CbuGRAS32 secondary structure；D.CbuGRAS9 secondary structure；E.CbuGRAS22 secondary structure.图2CbuDELLAs蛋白三级结构预测A.CbuGRAS1蛋白三级结构；B.CbuGRAS2蛋白三级结构；C.CbuGRAS9蛋白三级结构；D.CbuGRAS22蛋白三级结构；E.CbuGRAS32蛋白三级结构。Fig.2Tertiary structure prediction of CbuDELLA proteinsA.Tertiary structure of CbuGRAS1；B.Tertiary structure of CbuGRAS2；C.Tertiary structure of CbuGRAS32；D.Tertiary structure of CbuGRAS9；E.Tertiary structure of CbuGRAS22.14344 卷植物研究2.4CbuDELLAs启动子顺式作用元件从楸树基因组序列提取CbuDELLAs转录起始位置前 2 000 bp序列，通过 PlantCare在线网站预测基因启动子顺式作用元件。预测结果显示，图3CbuDELLAs蛋白保守结构域与启动子顺式作用元件A.左：CbuDELLAs蛋白保守结构域；右：CbuDELLAs蛋白保守基序；B.CbuDELLAs启动子顺式作用元件分析。Fig.3Analysis of conserved domain of CbuDELLAs and cis-acting elements of CbuDELLAs promoterA.Left：conserved domain CbuDELLAs；Right：conserved motif of CbuDELLAs；B.Cis-acting elements of CbuDELLAs promoter.图4目的片段克隆及连接到pEASY-T1大肠杆菌菌液PCR检测M.DL5000 DNA Marker；7.阴性对照；A.楸树DELLA基因克隆（15.基因CbuGRAS1、CbuGRAS2、CbuGRAS22、CbuGRAS32、CbuGRA9克隆产物）；B.pEASY-T1-CbuGRAS1在大肠杆菌菌液中的PCR检测（16.pEASY-T1-CbuGRAS1菌液PCR产物）；C.pEASY-T1-CbuGRAS2在大肠杆菌菌液中的PCR检测（16.pEASY-T1-CbuGRAS2菌液PCR产物）；D.pEASY-T1-CbuGRAS9在大肠杆菌菌液中的PCR检测（16.pEASY-T1-CbuGRAS9菌液PCR产物）；E.pEASY-T1-CbuGRAS22在大肠杆菌菌液中的PCR检测（16.pEASY-T1-CbuGRAS22菌液PCR产物）；F.pEASY-T1-CbuGRAS32在大肠杆菌菌液中的PCR检测（16.pEASY-T1-CbuGRAS32菌液PCR产物）。Fig.4Cloning of the target sequence and PCR detection of the fragment linked to E.coli pEASY-T1M.DL5000 DNA Marker；7.Negative control；A.Sequences of Catalpa bungei DELLAs（1-5.CbuGRAS1，CbuGRAS2，CbuGRAS22，CbuGRAS32，CbuGRA9 PCR products）；B.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS1 in E.coli（1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS1）；C.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS2 in E.coli（1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS2）；D.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS9 in E.coli（1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS9；E.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS22 in E.coli（1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS22）；F.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS9 in E.coli（1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS9）.144王珊珊等：楸树DELLA基因家族生信分析及CbuGRAS9的功能分析1 期CbuDELLAs基因启动子含有真核生物启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box（见图3B）。经可视化分析，CbuDELLAs基因启动子含有光响应作用元件、激素诱导元件（参与赤霉素反应的顺式作用调节元件和参与脱落酸反应的顺式作用调节元件）等，因此推断CbuDELLAs基因可能通过介导赤霉素信号通路参与 百日花 楸树的早花过程。2.5CbuDELLAs基因克隆利用附表1中的引物克隆基因片段，克隆产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，显示出的条带位置与目的序列大小一致（见图 4A）。将胶回收后的片段与pEASY-T1进行连接并转化大肠杆菌，随机挑取单克隆菌斑进行PCR检测（见图4），挑选检测结果正确的单克隆菌斑进行测序分析，测序结果与CbuDELLAs基因序列相似性高达99%以上。2.6CbuDELLAs在不同组织部位的特异性表达以9-1楸和 百日花 楸不同组织部位的cDNA为模板，检测CbuDELLAs基因的表达水平。结果表明，CbuDELLAs主要在顶芽和幼叶中表达，在茎和韧皮部中表达量较低。CbuGRAS9在9-1中整体表达量最高，CbuGRAS32 次之，CbuGRAS2 表达量整体最低（见图5A）。而在 百日花 楸中，除了木质部之外CbuGRAS9在各个组织部位表达量都最高，CbuGRAS32整体表达量高于CbuGRAS22，CbuGRAS2表达量最低（见图5B）。其中，CbuGRAS9在百日花 楸和9-1楸顶芽中的表达量差异最大，其在 百日花 楸中的表达量比在 9-1 楸中高达 26倍，由此推测CbuGRAS9基因可能在 百日花 楸早花中发挥关键作用。图5组织特异性表达分析A.CbuDELLAs在 9-1 楸不同组织中表达分析；B.CbuDELLAs基因在 百日花 楸不同组织中表达分析；*代表P0.05，*代表P0.01，*代表P0.001。Fig.5Tissue-specific expression analysis of CbuDELLAsA.Expression analysis of CbuDELLAs among different tissues in Catalpa bungei Luoqiu No.1；B.Expression analysis of CbuDELLAs among different tissues in Catalpa Bairihua；*represented P value was less than 0.05，*represented P value was less than 0.01，*represented P value was less than 0.001.14544 卷植物研究2.7pROK-CbuGRAS9 转基因植株的表型鉴定及功能分析将 CbuGRAS9 构建至 pROK 载体并转化至农杆菌中，使用浸花法侵染拟南芥，创制由35S启动子驱动的过表达拟南芥植株。以 T3 代拟南芥DNA进行PCR鉴定，电泳检测结果显示DNA条带与目标序列条带大小一致，证明目的载体成功转入拟南芥（见图6C）。表型观察发现，转基因株系的开花时间明显被推迟，且转基因株系的叶片大小、株高等指标也明显受到抑制（见图6AB）。选取最显著的 3个株系进行 qRT-PCR分析，发现转基因拟南芥中CbuGRAS9基因表达量显著提高（见图6D）。以上结果表明，CbuGRAS9基因参与介导植物的开花过程。2.8CbuGRAS9蛋白亚细胞定位使用Plant-mPloc在线网站对CbuGRAS9蛋白进行亚细胞定位预测，发现其定位于细胞核。为了验证这一预测，构建 pGWB405-35S：CbuGRAS9-GFP载体，将构建的载体及空载分别瞬时转化至烟草叶片中，通过激光共聚焦显微镜观察GFP荧光信号观察，证实CbuGRAS9是核定位蛋白（见图7A）。2.9筛选与CbuGRAS9互作的蛋白为揭示CbuGRAS9蛋白介导楸树早花的分子机制，是否通过结合蛋白质调节信号转导途径，使用楸树酵母文库筛选可能与CbuGRAS9互作的蛋白质，利用高通量测序进一步分析互作蛋白质的生物学过程与分子功能。将 构 建 好 的 pGBKT7-CbuGRAS9 载 体 转 入Y2HGold 酵母菌液中，在 SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His（QDO）培 养 基 上 30 培 养 72 h，pGBKT7-CbuGRAS9酵母菌落生长正常，说明CbuGRAS9蛋白存在转录激活活性且无毒性；将 CbuGRAS9蛋白分图6CbuGRAS9基因异源转化表型观察及表达模式分析AB.左侧为野生型拟南芥，右侧为过表达CbuGRAS9转基因拟南芥。阳性鉴定后，选取3株分别取叶片进行qRT-PCR分析；C.转基因拟南芥DNA水平检测；M.DL5000 DNA Marker（16.转基因株系PCR产物；7.阳性对照；8.野生型拟南芥；9.ddH2O作为阴性对照）；D.转基因拟南芥qRT-PCR检测（WT.野生型拟南芥株系；L1L3.转基因拟南芥株系）；*P0.001。Fig.6Phenotype observation and expression pattern analysis of heterologus transformation of CbuGRAS9A-B.The left side of wild-type Arabidopsis thaliana，the right side over-expression of CbuGRAS9 Arabidopsis thaliana.After positive identification，three strains were selected and leaves were taken for qRT-PCR analysis；C.Detection of transgenic Arabidopsis DNA level（M.DL5000 DNA Marker；1-6.PCR products of transgenic lines；7.Positive control；8.Wild type Arabidopsis thalianas；9.ddH2O as a negative control）；D.qRT-PCR detection of transgenic Arabidopsis thaliana（WT.Wild-type Arabidopsis thaliana；L1-L3.Transgenic Arabidopsis thaliana）；*represented P value was less than 0.001.146王珊珊等：楸树DELLA基因家族生信分析及CbuGRAS9的功能分析1 期为4段分别构建至pGBKT7载体中并转入Y2HGold中，在QDO培养基上培养，结果表明CbuGRAS91-552区间存在转录激活活性且无毒性（见图7B）。将 CbuGRAS9 基 因 无 转 录 激 活 活 性（553 1 662 bp）的片段构建至pGBKT7载体中，与实验室保存的楸树 cDNA 核蛋白二代文库进行杂交，在QDO培养基上进行筛选；每1015个单菌落混合后进行PCR鉴定，电泳结果显示每个混合样品均有条带且大小有明显差异，证明与文库互作成功（见本刊网站电子附图1）。将所有的PCR产物纯化回收后进行高通量测序，共筛选到 2 392 个蛋白，其中包含103个转录因子（见本刊网站电子附件 2）。将筛选到的全部基因进行基因本体论（GO）分析，结果显示在生物学过程分类中，代谢、细胞和单个组织进程的条目被明显富集；在细胞组学分类中，主要富集在细胞组分；在分子功能分类中，结合和催化活性条目被明显富集（见图8A）。KEGG富集分析结果，与CbuGRAS9互作的蛋白主要在核糖体、氨基酸合成、次级代谢、光合作用、TCA循环等代谢通路（见图8B）。图7CbuGRAS9亚细胞定位及转录激活活性分析A.35S：CbuGRAS9-GFP；CbuGRAS9与GFP的融合载体；B.CbuGRAS9转录激活活性分析。Fig.7Sub-cellular localization and transcriptional activa