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牛分枝杆菌Mb0869c抑制外源性细胞凋亡的研究.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第7期2023年7月Vol.45,No.7Jul.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202210025牛分枝杆菌Mb0869c抑制外源性细胞凋亡的研究梁秋韵,孟祥苗,杨可,黄蓓,宋厚辉*,杨杨*(浙江农林大学 动物科技学院/动物医学院 浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室,浙江 杭州311300)摘要:为探究与人
2、受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)存在互作的牛分枝杆菌()Mb0869c蛋白对细胞凋亡的作用机制,本研究通过PCR从DNA中扩增基因片段后构建重组质粒pMN437-Mb0869c并经PCR和测序鉴定正确后,利用电转化法将重组质粒电转入耻垢分枝杆菌(MS)中,并经western blot鉴定Mb0869c蛋白的表达情况。结果显示,重组菌株中出现约55 ku的特异性条带,表明获得了表达Mb0869c的重组菌MS_ Mb0869c。将MS_Mb0869c株和对照菌株MS_Vec分别感染人单核巨噬细胞(THP-1),通过PI和Annexin/FITC染色,经流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,结果显示,M
3、S_Mb0869c感染细胞的凋亡率显著低于MS_Vec感染组,这表明Mb0869c可以抑制MS诱导的细胞凋亡。将上述获得的Mb0869c基因片段克隆于pLVX-IRES-Puro-3伊Flag中,构建的重组质粒经测序鉴定正确后,转染HEK293T细胞中,利用嘌呤霉素筛选表达Mb0869c的细胞并经western blot鉴定。结果显示,构建的HEK293T细胞中出现约55 ku的特异性条带,且随着细胞传代次数的增加,蛋白表达量未减少,这表明稳定表达Mb0869c的细胞系HEK293T/Mb0869c正确构建。利用不同浓度的肿瘤坏死因子琢(TNF-琢)和IAP抑制剂(SM164)作用于HEK29
4、3T细胞,通过检测细胞内ATP的含量确定细胞凋亡发生情况。结果显示,100 ng/mLTNF-琢和25 nmol/L SM164在作用细胞24 h后,诱导细胞凋亡的效果最佳。以该浓度分别作用于HEK293T/Mb0869c和对照组HEK293T/Con细胞24 h后,统计细胞的存活率。结果显示前者的存活率极显著高于后者(0.01),表明Mb0869c能够抑制细胞凋亡。通过PCR扩增人RIPK1的3个结构域片段,并分别克隆至pCMV-Myc中构建真核表达重组质粒并经菌落PCR和测序鉴定正确后分别转染HEK293T/Mb0869c细胞,通过免疫共沉淀法(Co-IP)检测RIPK1结构域与Mb086
5、9c的互作。结果显示Mb0869c和RIPK1的激酶结构域(KD)和中间结构域(ID)存在相互作用。上述结果表明,Mb0869c蛋白在抑制细胞凋亡中具有重要的作用,且这种抑制作用是通过RIPK1实现的。本研究为蛋白通过RIPK1调节细胞凋亡作用机制的研究提供实验依据。关键词:牛分枝杆菌;细胞凋亡;Mb0869c;受体相互作用蛋白激酶1中图分类号:S852.61文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)07-0729-08Study onMb0869c inhibitingexogenous apoptosisLIANG Qiu-yun,MENG Xiang-miao,YANG Ke
6、,HUANG Bei,SONG Hou-hui*,YANG Yang*(Key Laboratory of Applied Technology on Green-Eco-Healthy Animal Husbandry of Zhejiang Province,Zhejiang Provincial EngineeringResearch Center for Animal Health Diagnostics&Advanced Technology,Zhejiang International Science and Technology Cooperation Base forVeter
7、inary Medicine and Health Management,China-Australia Joint Laboratory for Animal Health Big Data Analytics,College of AnimalScience and Technology&College of Veterinary Medicine,Hangzhou 311300,China)收稿日期:2022-10-31基金项目:国家自然科学基金资助项目(32272951);浙江省自然科学基金资助项目(LY21C180001);浙江省属高校基本科研业务费(2020YQ008)作者简介:梁
8、秋韵(1995-),女,江苏扬州人,硕士研究生,主要从事兽医公共卫生学研究.*通信作者:E-mail:;*Corresponding authorAbstract:To investigate the mechanism of apoptosis induced by a protein fromthat interacts withreceptor-interacting protein kinase 1(RIPK1),Mb0869c fragment was amplified fromgenomic DNA usingPCR and recombinant plasmid pMN437-
9、Mb0869c was constructed.Subsequently,recombinant plasmids were electrotransformedintoto generate recombinant bacteria expressing Mb0869c protein,and the presence of 55ku specificband was verified by western blot,showing that the recombinant bacteria MS_Mb0869c was successfully constructed.Afterward,
10、THP-1 cells were infected with MS_Mb0869c and control strain MS_Vec,respectively,and the apoptosis was analyzed withAnnexin V/FITC/PI staining flow cytometry.The results showed that the apoptosis rate of MS_Mb0869c infected cells wassignificantly lower than that of MS_Vec infected cells,indicating t
11、hat Mb0869c could inhibit cell apoptosis induced by.Further,the obtained Mb0869c fragment was inserted into pLVX-IRES-Puro-3伊Flag and transfectedinto HEK293T cells after sequencing verification.The stable cell line expressing Mb0869c was obtained by puromycin selectionand confirmed by western blot a
12、nalysis.Of note,the expression of Mb0869c in HEK293T did not decrease as cell passageincreased,indicating that a stable cell line expressing Mb0869c,HEK293T/Mb0869c,was successfully constructed.HEK293T cellswere treated with different concentrations of tumor necrosis factor-琢(TNF-琢)and IAP inhibitor
13、(SM164),and the apoptosis wasdetermined by measuring the content of intracellular ATP.This result showed that 100 ng/mL of TNF-琢and 25 nmol/L of SM164had the best effect on inducing cell apoptosis 24 hours after treatment with HEK293T/Mb0869c and HEK293T/Con by measuringcell viability.The cell survi
14、val rate of the former was significantly higher than that of the latter,indicating that Mb0869c indeedsuppressed cell apoptosis.Furthermore,three domain fragments of human RIPK1 were amplified by PCR,inserted into thepCMV-Myc plasmid to construct recombinant eukaryotic expression plasmids,and transf
15、ected into HEK293T/Mb0869c cells aftercolony PCR and sequencing verification.The interaction between the RIPK1 domain and Mb0869c was detected byCo-immunoprecipitation analysis,and the results validated that Mb0869c interacted with the RIPK1 kinase domain(KD)andintermediate domain(ID).The above resu
16、lts showed that the Mb0869c protein is essential in inhibiting apoptosis by,and RIPK1 achieves this inhibition.This study provides a crucial experimental basis for the mechanism ofprotein regulating cell apoptosis through RIPK1.Key words:;apoptosis;Mb0869c;RIPK1牛分枝杆菌(,)是一种重要的人兽共患病原菌,可引发牛结核病,造成养牛业的经济
17、损失,同时也严重影响人类健康和食品安全1。巨噬细胞是感染的主要宿主细胞,感染后巨噬细胞处于抵抗分枝杆菌免疫反应的最前沿,可以促进免疫细胞从外周血募集到被感染区域,在早期起到清除或阻止病原体的作用2。细胞凋亡是宿主通过细胞凋亡小体隔离细菌和诱导机体适应性免疫反应限制病原感染的一种策略。分枝杆菌可以通过自身进化的一系列逃逸机制延缓细胞凋亡或促进其坏死,以促进其的复制和传播3-5。有研究表明,对细胞凋亡的抑制作用主要与TNF-琢诱导的信号通路有关,但对肿瘤坏死因子琢(TNF-琢)信号通路的具体调控机制并不清楚6。TNF是一种促炎细胞因子,对组织稳态的协调至关重要。受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)
18、和肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TNF receptor associat-ed death domain,TRADD)是TNF信号转导的主要参与者。然而,关于这两种分子对于细胞存活或凋亡控制功能的研究一直存在争议7。本研究室前期研究利用酵母双杂交系统筛选出了与人受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)互作的蛋白Mb0869c、Mb0383c和Mb23148,其中Mb0869c经序列比对,发现其与结核分枝杆菌Rv0846c有高达99.8%的同源性9。因此,本实验以耻垢分枝杆菌(,MS)为模式菌,构建了过表达Mb0869c的重组菌株,探究了Mb0869c对MS诱导的细胞凋亡的影响。通过TNF-琢和
19、IAP抑制剂(SM164),在HEK293T细胞中构建细胞凋亡模型,探究了Mb0869c对细胞存活的影响。此外,本实验还进一步明确了Mb0869c与RIPK1结构域的互作关系。这为进一步研究相关蛋白通过RIPK1调节细胞凋亡的作用机制提供数据支持。中 国 预 防 兽 医 学 报2023年730表1引物序列引物名称Primer namepLVX-Mb0869c-FpLVX-Mb0869c-RMyc-RIPK1-KD-FMyc-RIPK1-KD-RMyc-RIPK1-ID-FMyc-RIPK1-ID-RMyc-RIPK1-DD-FMyc-RIPK1-DD-RpMN437-HA-Mb0869c-Fp
20、MN437-HA-Mb0869c-R引物序列(5-3)Primer sequence(5-3)ATCAACGGGGAACCCCACAGCACGACCAATCCCAGTGGATTGGTCGTGCTGTGGGGTTCCCCGTTGATTGCCGGAATTCGCATGCAACCAGACATGTCCTTGAATGCGGGGTACCTCATAAATAAAAAGGCCTAAATTTTTCTTCAATGCCAGGCCGGAATTCGCTTAAGTCAATTAGAAGAAAGTGTATAAGAGGACGCGGGGTACCTCACAGACTAGTGGTATTATCAAAGATAGCTTGGTACTCCGGAAT
21、TCGCACGGATAAACACCTGGACCCAACGGGGTACCTTAGTTCTGGCTGACGTAAATCAAGCTAAGGAGGTTAATAATGCCCGAGCTGGGGCGTAGTCCGGCACGTCGTCA1材料与方法1.1菌株、质粒及细胞株大肠杆菌DH5琢感受态细胞、MS mc2115、pLVX-IRES-Puro-3伊Flag(之后简写为pLVX)、pCMV-Myc真核表达载体、pMN437原核表达载体、含有RIPK1全长基因片段的真核表达重组质粒(pCMV-Myc-RIPK1-FL)、人胚胎肾细胞293T(HEK293T)和人单核巨噬细胞(THP-1)均由本实验室保存。1.
22、2主要试剂2伊Phanta Max Master Mix、蛋白Marker和DNA Marker均购自南京诺唯赞生物科技有限公司;Golden View核酸染料、质粒小提试剂盒、PCR纯化试剂盒购自上海惠凌生物技术有限公司;Ligation high Ver.2购自TOYOBO公司;Lipofectamine2000转染试剂、胎牛血清和嘌呤霉素购自ThermoFisher公司;限制性内切酶I、d、R I、I、I均购自NEB公司;兔源HA-Tag单克隆抗体(MAb)购自CST公司;PMA、TNF-琢、IAP抑制剂(SM164)、兔源抗GAPDH MAb和兔源抗Myc MAb均 购 自Sigma公
23、 司;pMS2购 自 优 宝 生 物 公 司;CellTiter-GloR2.0 Cell Viability Assay购自Promega公司;鼠源抗Flag MAb购自上海碧云天生物技术有限公司;HRP标记的鼠抗兔IgG(IgG-HRP)抗体和羊抗鼠IgG-HRP购自JACKSON公司;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;兔源GroEL抗体由本实验室自制。1.3引物的设计与合成根据NCBI登录的基因序列(NC_002945.3)及人RIPK1基因序列(8737),利用SnapGene设计特异性引物(表1)。引物均由浙江擎科生物技术有限公司合成。1
24、.4重组菌株MS_Mb0869c的构建及鉴定以提取的基因组DNA为模板,利用pMN437-HA-Mb0869c-F/R引物经PCR扩增基因并克隆至经I/d双酶切后的pMN437载体中,构建重组原核表达质粒pMN437-Mb0869c,并经菌落PCR和测序鉴定。将pMN437-Mb0869c电转至MS感受态细胞中,同时将pMS2电转进MS感受态细胞中,作为阴性对照。获得的重组菌经超声破碎后,分别以兔源HA-Tag MAb(1颐1 000)和兔源GroEL(1颐1 000)为一抗,鼠抗兔IgG-HRP(1颐20 000)为二抗,经western blot鉴定重组蛋白的表达。挑取单菌落于37、200
25、 r/min培养至OD600nm值为0.60.8,收集菌体沉淀,阳性重组 菌 即 为 过 表 达Mb0869c的 重 组MS,命 名 为MS_Mb0869c,对照菌株命名为MS_Vec。1.5Mb0869c对MS诱导的细胞凋亡影响的检测将THP-1细胞以7伊105个/mL铺于12孔细胞培养板中,用100 ng/mL的PMA刺激24 h后,更换成新鲜培养基继续培养24 h,使THP-1细胞分化成巨噬细胞。分别用MS_Mb0869c和MS_Vec按照MOI 10感染THP-1细胞,4 h后加入含有200滋g/mL庆大霉素的培养基,以杀死细胞外的细菌;2 h后,弃上清,加入含50滋g/mL庆大霉素的
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