西瓜雄性不育类型的遗传学鉴定与胚胎学观察.pdf

中中 国国 瓜瓜 菜菜试验研究2024，37（2）：15-20收稿日期：2023-06-07；修回日期：2023-12-05基金项目：国家现代农业产业技术体系（CARS-25）；河南省农业科学院优秀青年科技基金项目（2022YQ12）；河南省农业科学院自主创新资助项目（2023ZC033）；河南省重大科技专项（221100110400）作者简介：高宁宁，女，助理研究员，主要从事西甜瓜分子育种研究。E-mail：通信作者：赵卫星，男，副研究员，主要从事西甜瓜育种与逆境生理研究。E-mail：杂种优势在提高作物产量、品质和抗性等方面发挥着重要作用，是目前生产实践中重要的作物改良途径，培育作物杂交新品种已成为国内外种业发展的主要方向1。西瓜属于异花授粉植物，杂种优势强，但在制种时需要人工授粉、套袋处理，制种成本高、工作量大且纯度难以保证2-3。雄性不育一直是育种研究的热点，在小麦4、玉米5、水稻6、辣椒7、黄瓜8等作物上已有大量研究，但有关西瓜雄性不育的研究较少9-10。在大豆11、辣椒12、甘蓝13等作物上对花药败育的细胞学鉴定研究已有相关报道，而关于西瓜雄性不育系花药细胞学观察和败育时期的研究鲜有报道。雄性不育遗传机制较为复杂，分为两种类型，一是核基因控制的细胞核雄性不育，其遗传规律符合孟德尔遗传定律；二是核基因与线DOI：10.16861/ki.zggc.202423.0377西瓜雄性不育类型的遗传学鉴定与胚胎学观察高宁宁，李晓慧，康利允，王琰，常高正，梁慎，李海伦，王慧颖，赵卫星（河南省农业科学院园艺研究所郑州450002）摘要：为了明确西瓜雄性不育材料的不育类型和花药败育时期，以西瓜雄性不育系 GMS4 为材料，对花蕾不育性状进行田间观察统计，利用石蜡切片法观察西瓜花药发育过程。结果表明，该材料不育性状由 1 对隐性基因控制，为细胞核雄性不育类型。可育株雄蕊发育正常，不育株雄蕊较小，花药干瘪无花粉，可育株和不育株雌蕊发育无明显差异，均可正常结瓜。从花药发育的整个过程来看，在花药发育早期，可育株和不育株花药结构形态差别不大，在小孢子母细胞减数分裂期，不育株异常绒毡层细胞过度增殖，体积小，排列不整齐，挤压药室，无二分体和四分体形成，在花药发育后期，无花粉粒形成，最终导致西瓜雄性不育发生。据此认为，花药败育发生时期在小孢子母细胞减数分裂期。关键词：西瓜；细胞核雄性不育；减数分裂；绒毡层中图分类号：S651文献标志码：A文章编号：1673-2871（2024）02-015-06Genetic identification and embryological observation of male sterilewatermelonGAO Ningning,LI Xiaohui,KANG Liyun,WANG Yan,CHANG Gaozheng,LIANG Shen,LI Hailun,WANG Huiying,ZHAO Weixing（Horticulture Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,Henan,China）Abstract:In order to determine the sterility type and anther sterilization period of male sterile watermelon,the male sterileline GMS4 was used as the material to observe the sterility characters of flower buds in the field,and the developmentprocess of watermelon anther was observed by the paraffin section method.The results showed that the sterile materialwas controlled by a pair of recessive genes,which was the type of nuclear male sterility.The stamen of fertile plant wasnormal while that of sterile plant was small,with shripped auther and no pollen.There was no difference in pistildevelopment between fertile strain and sterile plant,and both of them could bear fruit normally.In the early antherdevelopment,there was little difference in anther structure and morphology between fertile and sterile plants.In the meioticphase of microspore mother cells,the abnormal tapetum cells proliferate excessively,were small in size,irregular inarrangement,squeezed drug chamber,and no dyad and tetrad were formed.No pollen grains were formed at the lateanther development stage,which resulted in male sterility.It concluded that anther abortion occurred during the meiosisstage of microspore mother cells.Key words:Watermelon;Nuclear male sterility;Meiosis;Tapetal layer15中国瓜菜第37卷试验研究粒体基因共同控制的核质互作雄性不育，表现为母系遗传14。根据雄性不育的表型和细胞学形态，花药败育的表现有以下几种：雄蕊畸形或退化；孢子囊退化，花药表型正常但没有花粉；小孢子退化，产生畸形败育的花粉；花粉功能缺陷，花粉表型正常但无萌发能力；花药不开裂，花粉有活力但开裂异常15-16。GMS4 西瓜材料在田间选育过程中发现部分植株雄花开放后花药无花粉。利用雄性不育材料进行育种能够提高制种效率，但小孢子败育原因较为复杂，且败育时期从造孢细胞以后的每个发育阶段都有可能发生17，明确败育发生的原因及时期对雄性不育系在杂种优势利用和生产实践中具有重要意义。因此，笔者以雄性不育系 GMS4 为材料，鉴定其雄性不育性状、采用细胞学方法观察花药发育时期，明确其败育时期，初步解析败育原因，以期为深入研究雄性不育分子调控机制和不育性状育种应用提供理论依据。1材料与方法1.1材料试验材料为西瓜雄性不育系 GMS4，由河南省农业科学院园艺研究所西甜瓜课题组提供。2020年 3 月至 2022 年 7 月在河南省农科院原阳基地进行试验，采用基质穴盘育苗，定植行株距为1.1m0.4m。1.2方法1.2.1取样在盛花期调查西瓜植株育性，通过田间观察、镜检等，统计雄性可育株和不育株，并分别进行标记。采集雄性可育和不育植株雄花花蕾，按照不同发育时期花蕾长度进行取样，参考前人研究18，分别为造孢细胞期0.5 mm、花粉母细胞期0.51.5 mm、减数分裂期 23 mm、单-双核小孢子期45 mm 和当天开放的雄花，雄花花蕾的长度为花托底部至花蕾顶部，每个时期取 3 个花蕾，3 次重复。利用 Nikon Eclipse E100 显微镜进行镜检和图像采集分析。1.2.2石蜡制片将花蕾放入盛有 FAA 溶液的离心管中进行花药固定，石蜡切片制作参考高俊凤19的方法。植物组织切片浸入染液 25 min 后水洗，镜检，观察着色情况，用自来水冲洗后，将切片置于烤箱内烘干；透明封片：切片放入干净的二甲苯透明 10 min，采用中性树胶封片。将切片置于显微镜下，观察花药发育过程。1.2.3遗传学鉴定对雄性不育材料 F2代 523 个植株和测交群体 460 个植株进行田间观察，分别统计可育株和不育株，并计算可育株和不育株的分离比。2结果与分析2.1雄性不育材料性状鉴定通过田间观察鉴定，该材料雄性不育性状稳定，F2代（396 127）和测交群体（239 221）中（图 1），雄性可育和不育的分离比稳定在 3 1 和 1 1，遗传注：A.雄性不育材料测交；B.雄性不育材料 F1代自交；C.雄性不育材料 F2代和测交群体。比例尺为 20 mm。Note:A.Male sterile material test cross;B.Male sterile material F1generation self-cross;C.F2generation of male sterile material and test crosspopulation.The scale is 20 mm.图 1雄性不育材料田间杂交、自交Fig.1The male sterile material crossbred and self-bred in the field16第2期，等：西瓜雄性不育类型的遗传学鉴定与胚胎学观察试验研究规律符合孟德尔遗传定律，不育性状由 1 对隐性基因控制，为细胞核雄性不育类型。2.2雄性不育和可育材料花器官特征通过田间鉴定，GMS4 不育系的不育性状稳定，不同发育时期雄性可育株与不育株的雄花形态差异较大，雄性可育株的花瓣颜色为深黄色，而不育株的花瓣颜色为浅黄色（图 2-AB），可育株的雄花花药较饱满（图 2-D），开花以后有黄色花粉散出（图2-E、G），显微镜下可观察到有活性的花粉粒（图2-I），雄性不育株的雄花花蕾在减数分裂期以后，花药发育缓慢，花药明显小于可育株（图 2-D），开花以后没有花粉散出（图 2-F、H），显微镜下观察不到花粉粒的存在。雄性不育株雌花发育与可育株无明显差异，授粉后可以正常结瓜（图 2-C）。注：A.不同发育时期雄性可育株雄花形态；B.不同发育时期雄性不育株雄花形态；C.雄性可育株（左）和不育株（右）雌花形态；D.雄性可育株（左）和不育株（右）雄花形态；E、G.雄性可育株雄花开放形态；F、H.雄性不育株雄花开放形态；I.雄性可育株花粉粒。AH 比例尺为 5 mm，I 比例尺为 100 m。Note:A.Male flower morphology of male fertile plants in different developmental stages;B.Male flower morphology of male sterile plants atdifferent developmental stages;C.Female flower morphology of male fertile（left）and sterile（right）plants;D.Male flower morphology of male fer-tile（left）and sterile（right）plants;E&G.Male flower open form of male fertile plant;F&H.Male flower open form of male sterile plant;I.Pollengrains of male fertile plant.The scale ofA-H is 5 mm,and the scale of I is 100 m.图 2雄性可育和不育材料花表型特征Fig.2Floral phenotypic characteristics of male fertile and sterile materials2.3雄性不育和可育材料花药发育特征通过切片观察，发现在造孢细胞时期，雄性可育株和不育株的花药细胞结构和形态差异不明显（图 3-AB）；花粉母细胞时期，花药细胞开始分化形成不同的形态结构，雄性可育株花药壁分化为由外到内的表皮层、药室内壁层、中层和绒毡层，绒毡层在药室最内层，呈长方形，排列整齐，为花粉母细胞提供营养。小孢子母细胞呈圆形，较大且排列松散（图 3-C）。与可育株相比，雄性不育株花药的药室壁和绒毡层的界限模糊不清，绒毡层细胞多层、不规则且细胞体积小，花粉囊受挤压，花粉囊较小，小孢子母细胞较小且排列紧密（图 3-D）；减数分裂期，能明显观察到雄性可育株的二分体和四分体，绒毡层细胞排列整齐（图 4-A），而雄性不育株花药绒毡层细胞过度增殖，排列不整齐，挤压药室，无二分体和四分体形成，异常小孢子母细胞在药室中聚集成团（图 4-B）；单-双核小孢子时期，雄性可育株花药绒毡层细胞增大，形成空泡，小孢子产生（图4-C），雄性不育株花药绒毡层增殖膨大，花粉囊受挤压变得狭小，不能形成正常的小孢子，仅形成了空泡的异常小孢子，着色较浅（图 4-D）；花粉粒成熟期，可育株花粉粒圆形且着色深，绒毡层细胞降解，花药开裂，成熟花粉粒散出（图 5-A），而不育株花药观察不到成熟花粉粒，整个药室呈干瘪状，粘连在一起，形成着色深的条带（图 5-B）。从切片观察发现，西瓜雄性可育株花药在各个时期的发育均正常。而不育株花药除前期造孢细胞时期发育正常，后期发育均存在异常。高宁宁，等：西瓜雄性不育类型的遗传学鉴定与胚胎学观察17中国瓜菜第37卷试验研究注：A.雄性可育株造孢细胞期；B.雄性不育株造孢细胞期；C.雄性可育株花粉母细胞期；D.雄性不育株花粉母细胞期；Ep.药室表皮；En.药室内壁；Ml.中层；Sc.造孢细胞；T.绒毡层；Ps.花粉囊；M.小孢子母细胞；aT.异常绒毡层：多层且细胞体积小。比例尺为 50 m。Note:A.Spore-forming cell stage of male fertile plant;B.Spore-forming cell stage of male sterile plant;C.Pollen mother cell stage of malefertile plant;D.Pollen blast stage of male sterile plant;Ep.Pharmacy epidermis;En.Anther interior wall;Ml.Middle layer;Sc.Spore-formingcell;T.Tapetum;Ps.Pollen sac;M.Microspore mother cell;aT.Abnormal tapetum:multiple layers and small cell size.The scale is 50 m.图 3花药减数分裂前Fig.3Before anther meiosis注：A.雄性可育株减数分裂期；B.雄性不育株减数分裂期；C.雄性可育株单-双核小孢子期；D.雄性不育株单-双核小孢子期；Tds.四分体；aT（图 B）.异常绒毡层：过度增殖、排列不整齐；aM.异常小孢子母细胞，无二分体和四分体；Msp.小孢子；aT（图 D）.异常绒毡层：增殖膨大挤压药室；aM.异常小孢子母细胞：空泡小孢子。比例尺为 50 m。Note:A.Meiotic stage of male fertile plant;B.Meiosis stage of male sterile plant;C.Male fertile strain mononuclear-dikaryotic microsporestage;D.Mononuclear microspore stage of male sterile plant;Tds.Tetrad;aT（Fig.B）.Abnormal tapetum:excessive proliferation,irregular arrange-ment;aM.Abnormal microspore mother cell:no dyad and tetrad;Msp.Microspore;aT（Fig.D）.Abnormal tapetum:proliferating and expandingextrusion chamber;aM.Abnormal microspore mother cell:vacuolar microspore.The scale is 50 m.图 4减数分裂和单-双核小孢子期Fig.4Meiosis and mononuclear-dikaryotic microspore stageCADBCADB18第2期，等：西瓜雄性不育类型的遗传学鉴定与胚胎学观察试验研究3讨论与结论花药是雄蕊的重要组成部分，花粉在花药中发育产生成熟花粉粒，之后进行传播授粉。花粉发育是一个复杂的过程，任何阶段发生异常均会引起雄性不育，败育形成的时期和原因多种多样，且依作物不同而异20-21。笔者研究发现，西瓜细胞核雄性不育系 GMS4 在不同的环境条件下性状稳定，其遗传规律符合孟德尔遗传定律，由一对隐性基因控制细胞核雄性不育。这与张显等22对西瓜雄性不育材料 Se18 的遗传特性研究结果相同。前人研究发现，雄花花蕾及花药的色泽、纵横径等外观特征与小孢子发育时期关系密切23。笔者的研究对 GMS4可育和不育花蕾的表型特征进行了观察比较，结果发现，雄性可育的花瓣颜色比不育的深，雄性不育株的花蕾纵径长至 23 mm 以后，花药大小明显小于可育株，开花以后，不育株雄花花药干瘪，无花粉产生。这与马建祥等24利用电镜扫描观察的西瓜雄性不育两用系结果一致。花蕾大小与花药发育时期之间的关系不仅受基因型的影响，同时受环境的影响也较大，因此，在深入研究之前需明确供试材料的花药败育时期。Laser 等20对被子植物花药发育过程的研究发现，双子叶植物花药败育时期多在四分体形成前，而单子叶植物的花药败育关键时期则主要是双核期。植物花药败育在花粉母细胞时期、减数分裂期、单-双核期等均有发生12，叶纨芝等25对白菜细胞核雄性不育系进行了花药细胞学观察，结果表明，不育系败育在减数分裂期，无法形成四分体。盛云燕等26利用电镜观察了甜瓜核雄性不育材料的花蕾发育结构，发现花药败育发生在四分体期至单核期。张建奎等27研究发现，小麦核雄性不育败育发生在小孢子单核期，败育类型为圆败型。而在笔者的研究中，西瓜雄性不育系 GMS4 的花药败育发生在小孢子母细胞减数分裂期，不育株的花药不能形成二分体、四分体，这可能与所研究的作物种类不同有关。诸多报道表明，小孢子败育与绒毡层的异常发育有关。绒毡层细胞位于花药壁内侧与小孢子母细胞接触，花药发育初期为小孢子提供所需的营养元素，四分体时期分泌特异性胼胝质酶，将包裹小孢子的胼胝体壁降解，花药发育后期提供孢粉素和脂类等28。研究表明，绒毡层发生任何异常如绒毡层细胞液泡化、提前退化或降解等都可能引起雄性不育。唐鑫等13对油菜温敏细胞核雄性不育系160S 花药进行细胞学研究，发现不育花药绒毡层形态异常，细胞空泡化并提前解体。雷刚等12研究辣椒细胞质雄性不育系 B351A 小孢子败育细胞学机制，表明败育花药绒毡层细胞高度液泡化，挤压药室产生畸形的花粉母细胞导致败育。与雷刚等12、唐鑫等13的细胞学观察结果不同，这可能与研究的不育类型不同有关。许明等29对大白菜核雄性不育两用系的研究发现，不育株花药进入减数分裂期后，四分体形成异常，在药室中央聚成团，绒毡层细胞异常呈液泡化，膨大后挤压药室，小孢子得不到充足营养而无法形成花粉粒。王永琦等30对西瓜细胞核雄性不育两用系 Se18 的研究同样表明，异常绒毡层细胞过度增殖，无法分泌胼胝质酶，被胼胝质包裹的小孢子只进行了细胞核分裂，细胞质未分裂，四分体无法形成，小孢子母细胞减数分裂异常注：A.雄性可育株花粉粒成熟期；B.雄性不育株花粉粒成熟期；Mp.成熟花粉；dPs.开裂花粉囊。aM.异常小孢子母细胞：无花粉，整个药室呈干瘪状。比例尺为 50 m。Note:A.Pollen grain maturity stage of male fertile plant;B.Pollen grain maturity stage of male sterile plant;Mp.Mature pollen;dPs.Dehiscentpollen sac.aM.Abnormal microspore mother cell:no pollen,the whole chamber is wizened.The scale is 50 m.图 5花粉粒成熟期Fig.5Mature stage of pollen grainsBA高宁宁，等：西瓜雄性不育类型的遗传学鉴定与胚胎学观察19中国瓜菜第37卷试验研究导致雄性不育发生。许明等29和王永琦等30的报道与本研究结果一致。在笔者的研究中，不育花药绒毡层细胞在小孢子母细胞减数分裂期发生异常，绒毡层细胞数量多、体积小且层数多，花粉囊受挤压，无法形成二分体和四分体，异常的绒毡层细胞无法给小孢子正常发育提供营养而导致败育。参考文献1赵卜，张向展，郑炜君，等 F 型小麦雄性不育系小孢子发育的细胞学观察J 麦类作物学报，2015，29（7）：918-9252马双武，王吉明，何红华 我国西瓜雄性不育系的研究利用J中国瓜菜，2006，19（5）：28-303武兴丽，刘寅安 西瓜雄性不育两用系一代杂种制种技术J北方园艺，2003（2）：32-334魏霁桐，吴国丽，李慧敏，等 小麦生理型雄性不育系花药内源JA 与 ABA 含量动态变化及其代谢通路差异基因表达研究J麦类作物学报，2021，41（7）：787-7985郭瑶晴，孙晓靖，连玉杰，等 玉米雄性不育突变体 x50 的基因定位与遗传分析J 华北农学报，2023，38（1）：17-226唐焱锋，余东，袁定阳 水稻雄性不育类型及不育机制的研究进展J 杂交水稻，2023，38（2）：1-117杨慧萍，潘路招，汤冰倩，等 辣椒细胞质雄性不育突变体CMS102 的败育机理及其育性遗传J 湖南农业大学学报（自然科学版），2022，48（4）：423-4298杨志敏，岳宏忠，张海强，等 黄瓜雄性不育突变体 C0128 的鉴定与不育基因的初步定位J 西北植物学报，2022，42（6）：901-9089ZHANG R M，CHANG J J，LI J Y，et al Disruption of thebHLH transcription factor Abnormal Tapetum 1 causes malesterility 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