牦牛TBC1D7基因克隆、生物信息学及表达分析.pdf
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1、2024年第44卷第2期中国草食动物科学Vol.44 No.2 2024China Herbivore ScienceDOI:10.3969/j.issn.2095-3887.2024.00.033牦牛TBC1D7基因克隆、生物信息学及表达分析张娟香1,2,欧杰次仁3,喇永富1,马晓明1,吴晓云1,郭宪1,褚敏1,阎萍1,梁春年1(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省牦牛繁育重点实验室,农业农村部青藏高原畜禽遗传育种重点实验室,兰州730050;2.甘肃农业大学动物科学技术学院,兰州730070;3.西藏娘亚牦牛养殖产业发展有限责任公司,嘉黎852400)摘要:为探究西藏牦牛Tre2
2、-Bub2-CDC16 结构域家族成员7(TBC1D7)基因的特征及结构,利用RT-PCR 克隆了TBC1D7基因的CDS区序列,并对其进行了生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测了TBC1D7基因在牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉及脂肪组织的表达水平。结果表明,牦牛TBC1D7基因的CDS区全长为882 bp,共编码293个氨基酸;系统进化树分析结果表明,西藏牦牛与野牦牛的亲缘关系最近,与兔的最远;生物信息学分析结果表明,牦牛TBC1D7蛋白不存在信号肽和跨膜结构,属于亲水性蛋白,主要存在细胞核中,且该蛋白具有24个潜在的磷酸化位点,蛋白的高级结构由-螺旋(65.53%
3、)、延伸连(3.75%)、-转角(3.75%)和无规则卷曲(29.96%)构成。qPCR检测结果显示,TBC1D7基因在西藏牦牛脾脏组织中的表达最高,极显著高于其他组织(P 0.01)。关键词:西藏牦牛;TBC1D7基因;克隆;生物学分析;组织表达中图分类号:S823.8+5文献标志码:A文章编号:2095-3887(2024)02-0010-08Cloning,Bioinformatics Analysis and Expression Analysis of TBC1D7 Gene in YakZHANG Juanxiang1,2,OJIE Ciren3,LAYonfu1,MA Xiaom
4、ing1,WU Xiaoyun1,GUO Xian1,CHU Min1,YAN Ping1,LIANG Chunnian1(1.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Key Laboratory of Yak Breeding in Gansu Province,Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding onTibetan,Ministry of Agriculture and
5、 Rural Affairs,Lanzhou 730050,China;2.College of Animal Science andTechnology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;3.Tibet Niangya Yak BreedingIndustry Development Limited Liability Company,Jiali 852400,China)Abstract:In order to investigate the characteristics and structure of Tre2-Bu
6、b2-CDC16 structural domain family member 7(TBC1D7)gene in Tibetan yak(Bos grunniens),the sequence of the CDS region of the TBC1D7 gene was clonedusing RT-PCR.And bioinformatics analysis,real-time fluorescence quantitative PCR(qPCR)was used to detect theexpression levels of TBC1D7 gene in heart,liver
7、,spleen,lung,kidney,muscle and adipose tissues of yaks.The resultsshowed that the CDS region of the yak TBC1D7 gene was 882 bp in length,encoded a total of 293 amino acids;Theresults of the phylogenetic tree indicated that the Tibetan yak was most closely related to the wild yak and more distantlyre
8、lated to the Oryctolagus cuniculus;The yak TBC1D7 protein was free of signal peptide and transmembrane structures,it was a hydrophilic protein and mainly found in the nucleus,it had 24 potential phosphorylation sites.The advancedstructure of the protein was consisted of-helices(65.53%),stretching-li
9、nks(3.75%),-turns(3.75%),and irregularcoiling(29.96%).qPCR results showed that the TBC1D7 gene was most highly expressed in the spleen tissues of收稿日期:2024-01-10基金项目:西藏自治区区域科技协同创新项目(QYXTZX-NQ2022-04);国家重点研发计划项目(2022YFD1302101);现代肉牛牦牛产业技术体系项目(CARS-37)作者简介:张娟香(1998-),女,硕士研究生,研究方向为动物遗传育种与繁殖通信作者:梁春年(1973
10、-),男,研究员,研究方向为动物遗传育种与繁殖-10张娟香,欧杰次仁,喇永富,等.牦牛TBC1D7基因克隆、生物信息学及表达分析J.中国草食动物科学,2024,44(2):10-17Tibetan yaks,which was highly significantly higher than other tissues(P A位点为影响关岭牛生长发育的重要多态位点,推测TBC1D7基因在调控畜禽生长发育方面发挥作用13。目前,TBC1D7基因在牦牛上的研究尚未见报道,本研究以西藏牦牛为研究对象,克隆TBC1D7基因的编码区序列并对其进行生物学分析,利用荧光定量PCR检测该基因在西藏牦牛不同组织
11、中的表达情况,为进一步研究TBC1D7基因在牦牛生长发育中的作用提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料从西藏自治区嘉黎县娘亚牦牛牛场选取3头体质健康的西藏牦牛,屠宰后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪等7个内脏组织,放入液氮中保存,运回实验室后转到-80冰箱保存备用。1.2主要仪器与试剂PCR 仪(Pro Flex TMPCR),电泳仪(DYY-6C),超微量分光光度计(Nano Drop 2000),凝胶成像系统(Tanon 2500),金属浴;M-MLV 反转录试剂盒、LATaq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker均采购自宝生物工程有限公司(北京)。1.3总RNA
12、的提取及反转录将采集的各组织样按照 Trizol法提取总 RNA,提取的RNA使用超微量分光光度计Nano Drop(Thermo,北京)检测其质量和浓度(OD260/OD280值在 1.82.0),检测合格后按照反转录试剂盒(TaKaRa,大连)中的操作方法将 RNA 反转录成 cDNA,存放在-20冰箱备用。1.4牦牛TBC1D7基因引物设计与合成利用 GenBank 中野牦牛的 TBC1D7 基因序列(登录号:NW_005394884.1),应用 Primers 软件设计用于克隆(RT-PCR)和实时荧光定量(qPCR)所需的特异性引物,引物由西安擎科生物科技公司合成(表1)。1.5牦牛
13、TBC1D7基因的克隆与测序采用西藏牦牛肾脏组织的cDNA为模板进行PCR特异性扩增。反应体系(25 L):ddH2O 8.5 L,2TaqPCR Master Mix 12.5 L,cDNA 2 L,上下游引物各1 L(10 mol/L)。扩增条件:94预变性30 s;98变性 10 s,退火 30 s(温度见表 1),72延伸 1 min,共 35个循环;72最终延伸2 min,4保存。扩增产物使用2%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统检查目的条带,与预期条带相符后送至西安擎科生物科技公司测序。1.6牦牛TBC1D7基因的生物信息学分析使用DNAstar软件进行拼接测序结果,利用表2中的多种在线
14、软件分析和预测西藏牦牛TBC1D7蛋白。1.7实时荧光定量PCR以西藏牦牛的 7个组织 cDNA 为模板,GAPDH 为-112024年第44卷第2期中国草食动物科学Vol.44 No.2 2024China Herbivore Science内参基因,利用 qPCR 技术检测 TBC1D7 基因在各组织中的表达量。反应体系(20 L)包括:2 SYBRGreen Pro Taq HS Premix 10 L,上、下游引物各0.4 L(10 mol/L),cDNA 1 L,ddH2O 8.2 L。反应程序:95预变性30 s;95变性5 s,57退火30 s,65延伸5 s,共40个循环;95
15、最终延伸5 min。1.8统计分析qPCR 结果采用 2-Ct方法进行统计分析,利用SPSS 23.0进行单因素方差分析。2结果与分析2.1西藏牦牛TBC1D7基因的扩增克隆以牦牛肾脏组织cDNA进行PCR扩增后,产物通过2%的凝胶电泳及成像系统检测,结果如图1所示。扩增产物长度分别在421、481、445、409、537、345、396 bp左右,扩增条带单一清晰,与预期目的条带大小一致。将产物送西安擎科生物技术有限公司测序,用于后续分析。2.2西藏牦牛TBC1D7基因mRNA CDS区序列分析获得测序结果后,利用DNAstar软件中的Seqman表1TBC1D7基因引物序列基因TBC1D7
16、-1TBC1D7-2TBC1D7-3TBC1D7-4TBC1D7-5TBC1D7-6TBC1D7-7TBC1D7GAPDH引物序列(53)F:TTGGGTCCTATACACGGGCAR:CACAACCGCTGCATTGGAAGF:TCTCCTCCGCTGTGAAACACR:GCTCTGTGCTGAAGTCACCTF:TGTGGTAGACAGCATCTCACAGR:AGGGAGACTGGGTCAGATTGTF:GATGGACTGGGTGCTTTTGGR:ACCTGGCCTCTTACTGCTGAF:TTTAGCCAGAGACTGCCCCAR:ATCACCAGTCGCTATGTCAGCF:ACAGC
17、AAGTGAGCCCATGAAR:TCTGGCTTGTAAACTGAACTCCF:CGCCTATGTGATCGCTTTCTGR:CAGAAGATGCCGTTCCACAACF:GCGTTGGTCTGGAAGGTGTTR:TGTAAGCTGGACTCGGGCAAF:AATGAAAGGGCCATCACCATCR:GTGGTTCACGCCCATCACA产物长度/bp429481445409537345396413204退火温度/58.757.157.458.459.658.659.657.057.0用途克隆克隆克隆克隆克隆克隆克隆实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR表2生物信息学分析软件分析工具ORF
18、 FinderBLASTProtParamProtScaleSignalP4.1TMHMM2.0NetPhos3.1NetNGlycPSORT SOPMASTRINGSWISS-MODEL功能开放阅读框分析同源性比对分析蛋白质理化性质分析蛋白质亲疏水性分析蛋白质信号肽分析蛋白质跨膜结构预测蛋白磷酸化位点预测蛋白糖基化位点预测蛋白亚细胞定位预测蛋白质二级结构预测蛋白互作网络预测蛋白质三级结构预测网址https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttps:/web.expasy.org/p
19、rotparamhttps:/web.expasy.org/protscalehttps:/services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0https:/ protein association networks
20、(string-db.org)https:/swissmodel.expasy.org/interactive-12张娟香,欧杰次仁,喇永富,等.牦牛TBC1D7基因克隆、生物信息学及表达分析J.中国草食动物科学,2024,44(2):10-17子程序进行拼接序列,将得到的拼接序列与NCBI数据库中野牦牛(登录号:NW_005394884.1)TBC1D7基因的 CDS 区 采 用 BLAST 软 件 比 对 可 知,西 藏 牦 牛TBC1D7基因的编码区长度为882 bp,与野牦牛的同源性为99.66%,该序列在第609 bp发生AC突变、在第660 bp发生AT突变,第663 bp发生GT
21、突变(图2)。通过蛋白序列比发现,该序列第203位处未知氨基酸突变为酪氨酸、第220位亮氨酸突变为苯丙氨酸以及第221位谷氨酰胺突变为组氨酸(图3)。通过开放阅读框(ORF Finder)预测可知,该序列共编码293个氨基酸,具有完整的开放阅读框882 bp。通过BioEdit软件分析碱基成分可知,A、T、C、G的含量分别为25.74%、25.17%、23.70%和25.40%。2.3牦牛TBC1D7基因同源性分析和系统进化树构建用MegAlign对西藏牦牛与野牦牛(XP_005904553.1)、牛(NP_001015643.1)、山 羊(XP_005696903.1)、绵 羊(XP_004
22、019179.2)、小 鹿(XP_061003596.1)、羊 驼(XP_006198694.1)、猪(XP_001928344.1)、骆驼(XP_031291039.1)、蓝鲸(XP_036724539.1)、北极熊(XP_008691027.1)、兔(XP_002714225.2)等物种的蛋白质序列进行同源性比对,结果如图4所示,与西藏牦牛同源性最高的是野牦牛,同源性达99.66%;与普通牛、山图3西藏牦牛与野牦牛TBC1D7蛋白第145位突变位点对比图2西藏牦牛与野牦牛TBC1D7基因第609位、660位和663位突变位点与测序峰图对比注:M.DL 1000 DNA Marker;17.
23、PCR扩增产物图1牦牛TBC1D7基因PCR扩增结果-132024年第44卷第2期中国草食动物科学Vol.44 No.2 2024China Herbivore Science羊、绵羊、小鹿、羊驼、猪、骆驼的同源性分别为98.63%,97.95%,97.61%,96.59%,94.54%,93.86%,92.57%。与蓝鲸、北极熊和兔的同源性较低,分别为92.49%,92.83%和 92.15%。利用 MEGA11 软件构建系统进化树可知(图5),西藏牦牛先与野牦牛(Bos mutus)聚为一支,再与普通牛聚为一大支;其次是小鹿(Dama dama)、山羊(Capra hircus)、绵羊(O
24、vis aries)聚为一支;蓝鲸(Balaenoptera musculus)和猪(Sus scrofa)单独聚为一支;羊驼(Vicugna pacos)和骆驼(Camelusdromedarius)聚为一支,最后与北极熊(Urus maritimus)和兔(Oryctolagus cuniculus)聚为一大支。可见,与西藏牦牛亲缘关系最近的是野牦牛,最远的是兔。2.4牦牛TBC1D7蛋白分析2.4.1蛋白质理化性质分析使用 ProtParam 软件分析 TBC1D7 蛋白理化性质,TBC1D7 蛋白的分子式为 C1541H2404N398O431S17、原子总数 4 791、相对分子质量
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