天然小分子药物小檗胺影响牛肠道病毒复制的研究.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第9期2023年9月Vol.45,No.9Sep.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202212025天然小分子药物小檗胺影响牛肠道病毒复制的研究李泽宇,段卓凡,邰安然,刘芯怡,刘心愿,于婷婷,文静,杨莉,付强*,史慧君*(新疆农业大学 动物医学学院,新疆 乌鲁木齐 830052)摘要:为分析天然小分子药物小檗胺(BBM)是否影响牛肠道病毒(BEV)的复制,本研究以不同浓度的BBM与牛肾细胞(MDBK)共孵育后,采用MTT法检测BBM对MD
2、BK细胞的影响,结果显示,与对照浓度相比,1滋mol/L、5滋mol/L、10滋mol/L BBM对细胞增殖抑制作用均较小(0.05)。因此选择上述3种浓度的BBM分别处理MDBK 12 h后以103TCID50BEV感染,24 h后采用间接免疫荧光试验(IFA)检测BEV双链RNA(dsRNA),以确定BBM对BEV的最佳抑制浓度。MDBK细胞经10滋mol/L BBM处理后感染BEV,观察48 h内BEV致细胞病变效应(CPE),采用荧光定量PCR检测BEV 5UTR mRNA转录水平及测定子代病毒滴度,以确定BBM体外对BEV的抑制效果。IFA结果显示,与对照组相比,10滋mol/L B
3、BM对BEV dsRNA具有极显著性抑制作用(0.01);细胞形态观察结果显示,BBM对BEV引起的细胞大面积脱落具有一定的抑制效果;荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,在感染48 h的细胞中BEV 5UTR mRNA转录水平极显著降低(0.01);子代病毒滴度测定结果显示,在BEV感染24 h和36 h时子代病毒滴度极显著降低(0.01)。小鼠预防试验时将24只BALB/c小鼠均分为3组,分别为对照组(0)、低剂量组(50 mg/kg)、高剂量组(100 mg/kg),每日将BBM灌胃1次。给药后3 d滴鼻感染1015TCID50BEV,间隔48 h重复感染一次。感染后分别于5 d、10
4、d剖杀各组小鼠并采集各组织,采用荧光定量PCR检测BEV 5UTR mRNA的转录水平。小鼠感染治疗试验时将48只BALB/c小鼠均分为BEV阳性对照组(BEV/DMSO)、感染给药组(BEV/BBM)、给药对照组(BBM),BEV阳性对照组和BEV/BBM组小鼠滴鼻感染1015TCID50BEV后,各组每天按原剂量灌胃BBM一次,感染后0、3 d、6 d和10 d剖杀各组小鼠并采集各组织,检测BEV 5UTR mRNA的转录水平,并制备病理切片观察各组织的病变。BALB/c小鼠预防试验结果显示,各浓度BBM均具有显著或极显著抑制BALB/c小鼠肝、脾、肾、小肠组织中BEV 5UTR mRNA
5、转录水平升高的作用(0.05或0.05).Microscopic examination of the BEV infection caused cell death,andBBM-inhibited cell death was performed.In addition,IFA showed that 10滋mol/L of BBM significantly reduced the accumulationof BVDV dsRNA(0.01).Besides,RT-qPCR showed that the level of BEV 5-UTR mRNA reduced consider
6、ably(0.01)afterBBM treatment for 72 hours.Moreover,viral titers decreased significantly after BBM treatment for 24 hours and 36 hours(0.01).Subsequently,the prevention and therapeutic of BEV infection in BALB/c mice were investigated.Twenty-four micewere randomly divided into three different groups
7、and treated with varying concentrations of BBM,named control group(0),lowdose group(50mg/kg),high dose group(100mg/kg)by oral administration every 24 hours,followed by infection with 1015TCID50/滋LBEV by nasal drip,and re-infection after 48 hours.Tissues were collected for RT-qPCR to determine the BE
8、V 5-UTR mRNAreplication level,and an inverted microscope observed histopathologic characteristics at 5 days and 10 days.Another forty-eightmice were randomly divided into three different concentration groups,named positive control group(0),high dose group(100mg/kg),and un-infection control group(100
9、mg/kg).The control and high-dose groups were infected with 1015TCID50/滋L ofBEV by nasal drip and given the indicated concentration BBM by oral administration every 24 hours.Tissues were collected forRT-qPCR to determine the effect of BEV 5-UTR mRNA replication level,and an inverted microscope observ
10、ed histopathologiccharacteristics at 0,3 days,6 days,and 10 days.The prevention experiment showed that BBM inhibited the BEV at differentconcentrations,significantly inhibiting the BEV 5-UTR mRNA level in the liver,spleen,kidney,and small intestine(0.01 or0.05).The histopathologic results showed tha
11、t BBM significantly inhibited the histopathologic changes in tissue,particularly inthe high-dose group.The therapeutic results showed that BBM inhibits BEV inflection in tissue from one day after infection.Thehistopathological result showed that hyperemia,bleeding,and inflammatory cell infiltration
12、were recovered.In conclusion,weconfirmed that BBM significantly inhibited BEV replicationand in,provided a new method for preventing and treatingBEV,and provided a reference for treating bovine diarrhea and developing BBM as an antiviral drug.Key words:natural small molecule drugs;berbamine;bovine e
13、nterovirus;viral replication牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV)是小RNA病毒科()肠道病毒属()的单股正链RNA病毒1,目前经分离鉴定得知BEV有两种血 清 型,牛 肠 道 病 毒1型(Bovine enterovirus-1,BEV-1)和2型(Bovine enterovirus-2,BEV-2)2。BEV感染后主要引起牛发热、腹泻、呼吸困难等,可引起新生犊牛死亡,感染动物黏膜、排泄物可大量排毒,并通过接触、环境中水体循环、飞沫等途径感染健康动物3,从而引发疫病的大面积流行,导致乳、肉牛生产性能下降,严重危害养牛业。国内相关治疗药物的研发
14、工作仍处于初级阶段,尚未进入临床治疗。因此,寻求治疗BEV的药物,尤其新型抗BEV药物显得尤为重要。天然小分子药物小檗胺(Berbamine,BBM)是从我国中草药小檗属植物中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱4。BBM具有促进白细胞增生、抗炎、抗结核、抗矽肺、抗肿瘤、降血压、抗心肌缺氧缺血、抗心律失常等多种生物学功能,目前已经用于癌症的化疗、放疗,慢性苯中毒后的免疫调节5-6。有研究报道BBM及其衍生物作为钙调蛋白拮抗剂对抑制脑恶性胶质细胞瘤、人宫颈癌细胞、腹水癌细胞及黑色素瘤细胞的增殖也有明显作用7;BBM可减少氧自由基对细胞的损害,减轻细胞内钙超载,对缺血组织有一定的保护作用8;还可通过抑制
15、细胞线粒体功能和细胞凋亡过程来改善异丙肾上腺素引起的心肌梗塞9。BBM的抗病毒作用也已逐步被中 国 预 防 兽 医 学 报2023年882挖掘,研究表明BBM可效抑制SARS-CoV-2(Severeacute respiratory syndrome coronavirus 2)及日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感 染10。但 对BEV是否具有类似作用,目前尚未见报道,因此,本研究首次对BBM是否在体内外具有抑制BEV复制的作用进行研究,为牛腹泻病治疗以及开发BBM为抗病毒药物提供参考依据。1材料与方法1.1病毒株和细胞致细胞病变型(Cytopa
16、thic ef-fect,CP)BEV分离株BL311由新疆农业大学动物医学学院抗病毒药物研究实验室分离并保存11。牛肾细胞(Madin-darby bovine kidney,MDBK)购自中国科学院上海细胞库。1.2主要试剂BBM(HY-N0714A)购自Med ChemExpress公司;DMSO购自美国Sigma公司;MTT试剂盒(ST316)购自上海碧云天生物技术有限公司;Anti-dsRNA MAb J2(10010200)购自美国SCICONS公司;PrimeScriptTMRT Master Mix(PerfectRealTime)(RR036A)试剂盒购自TaKaRa公司;S
17、YBR Green I荧光定量PCR试剂盒购自QIAGEN公司;细胞爬片(801010)购自无锡耐思生物科技有限公司;胎牛血清FBS、DMEM和青链霉素购自BI公司;CoraLite488标记的驴抗鼠IgG(H+L)购自武汉三鹰生物技术有限公司。1.3BBM对细胞增殖的影响待96孔细胞培养板中MDBK细胞汇合度达50%时,使用二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)将BBM浓度分别稀释为1滋mol/L、5滋mol/L、8滋mol/L、10滋mol/L、15滋mol/L、20滋mol/L,使用各浓度BBM分别处理各孔MDBK细胞0、12 h、24 h、36 h、48 h,更换
18、新鲜的100滋L细胞培养液和10滋L MTT溶液(终浓度为0.01 mol/L),37孵育4 h后弃上清,每孔加入150滋L DMSO,100 r/min避光振荡30 min,检测OD570nm值。各组结果以平均值依标准差表示,采用SPSS 17.0软件进行独立样本的 检验,比较组间数据的显著性差异,采用GraphPad Prism 5.0软件作图,分析BBM对细胞增殖的影响。*:0.05代表差异显著;*:0.01代表差异极显著。实验设仅含DMSO的MDBK细胞为对照组。1.4BBM对BEV dsRNA荧光变化影响的IFA检测待24孔细胞培养板中细胞爬片上的MDBK细胞汇合度达70%时,分别加
19、入1滋mol/L、5滋mol/L、10滋mol/L(根据1.3结果确定)BBM处理MDBK细胞,12 h后加入103TCID50BEV,继续培养24 h,使用4%多聚甲醛室温下固定20 min,更换成封闭液孵育1 h,以Anti-dsRNA MAb J2(1颐1 200)为一抗,以CoraLite488标记的驴抗鼠IgG(H+L)(1颐250)为二抗,置于常温下孵育2 h后加入PI染核,并使用PVP封片液封片,4避光晾干后于激光共聚焦显微镜下观察。实验设仅加DMSO的MDBK细胞为阴性对照组。1.5BEV感染BBM处理的MDBK细胞后复制情况的检测待6孔 细 胞 板 中MDBK细 胞 汇 合
20、度 达60%时,加入10滋mol/L BBM处理12 h,吸弃培养液后加入103TCID50BEV吸附2 h后PBS冲洗,分别于感染BEV后0、12 h、24 h、36 h、48 h时在显微镜下观察CPE并收集细胞和培养液,一部分用于提取RNA并反转录为cDNA,经荧光定量PCR检测试剂盒检测BEV 5UTR mRNA转录水平,使用GraphPad Prism 5.0作图分析BBM对BEV抑制情况;另一部分冻融3次裂解细胞,1 000 r/min离心取上清病毒悬液,病毒悬液10倍倍比稀释后,分别加入96孔细胞培养板中汇合度约70%的MDBK细胞中,吸附2 h后更换成5%FBS的培养液,每个稀释
21、度平行做8个复孔,病毒感染3 d5 d统计CPE,根据Reed-Muench法计算子代病毒的TCID50。上述各实验均设仅加DMSO,但BEV感染的MDBK细胞为阳性对照组。1.6BBM对BEV感染BALB/c小鼠的预防保护试验参照文献12,将24只BALB/c小鼠随机均分为高剂量实验组(100 mg/kg BBM灌胃BALB/c小鼠)、低剂量实验组(50 mg/kg BBM灌胃BALB/c小鼠)、BEV阳性对照组(仅灌服DMSO)。每24 h灌胃一次,连续3次后以浓度为1015TCID50/滋L BEV按10滋L/只小鼠滴鼻感染各组小鼠,48 h后以相同剂量再次感染,首次感染后每24 h各组
22、小鼠继续按相应剂量BBM灌胃。于首次感染后第5 d和10 d时分别对各组小鼠安乐死,每次每组4只,取肝、脾、肾、小肠等组织,常规处理后采用1.5中实时荧光定量PCR检测各组织内BEV 5UTR mRNA的转录水平,同时制备病理切片,观察组织病理变化。1.7BBM对BEV感染BALB/c小鼠的治疗试验将48只BALB/c小鼠随机均分成3组:BEV阳性对照组(BEV/DMSO)、感染给药组(BEV/BBM)、给药对照李泽宇,等.天然小分子药物小檗胺影响牛肠道病毒复制的研究第9期883组(BBM)。其中BEV阳性对照组和感染给药组小鼠均使用1015TCID50/滋L BEV按10滋L/只滴鼻感染,4
23、8 h后再次以同剂量感染,二次感染后感染给药组和给药对照组小鼠以100 mg/kg BBM灌胃小鼠。BBM每24 h灌胃一次,于给药后第0、3 d、6 d和10 d时分别剖杀各组小鼠,按1.6方法处理各组织并检测各组织中BEV 5UTR mRNA的转录水平,并同1.6中方法进行病理变化观察。2结果2.1BBM对MDBK细胞增殖影响的检测结果为分析BBM对MDBK细胞增殖的影响,本实验采用MTT法检测不同浓度BBM处理MDBK细胞于不同时间时细胞增殖情况,结果显示,与对照组相比,1滋mol/L、5滋mol/L、8滋mol/L、10滋mol/L、15滋mol/L和20滋mol/L BBM处理MDB
24、K细胞0和12 h时对细胞OD570nm值均无明显影响,BBM处理24 h时15滋mol/L和20滋mol/L细胞OD570nm值极显著降低(0.01)。可见随时间延长和BBM浓度增大,细胞活性也逐渐降低(图1)。表明BBM对MDBK细胞增殖抑制作用呈时间和剂量依赖性,且1滋mol/L10滋mol/L BBM处理24 h内对细胞增殖的抑制作用较小,因此选择该浓度范围BBM进一步试验。*:0.05,*:0.01,the same as below.图1BBM对MDBK细胞增殖影响的MTT法检测结果Hours post treatment with BBMNegative control1滋mol
25、/L5滋mol/L8滋mol/L10滋mol/L15滋mol/L20滋mol/L1.51.00.5048h36h24h12h02.2BBM对BEV dsRNA荧光变化影响的IFA检测结果采用不同浓度BBM预处理MDBK后感染BEV,通过IFA检测BBM对BEV dsRNA荧光的影响。结果显示,与阴性对照组相比,BBM对BEV dsRNA荧光形成有抑制作用,且随浓度增加而该抑制作用增强;其中1滋mol/L的BBM可使细胞质内特异性绿色荧光数量明显减少,10滋mol/L BBM处理的细胞质中的绿色荧光几乎消失(图2)。表明10滋mol/L BBM可有效抑制BEV的胞内复制,因此选取该浓度为最适抑制
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