牛病毒性腹泻病毒抗原胶体金快速检测试纸条的研制.pdf
《牛病毒性腹泻病毒抗原胶体金快速检测试纸条的研制.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《牛病毒性腹泻病毒抗原胶体金快速检测试纸条的研制.pdf(5页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、第45卷第12 期2023年12 月doi:10.3969/j.issn.1008-0589.202212010牛病毒性腹泻病毒抗原胶体金快速检测试纸条的研制中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary MedicineVol.45,No.12Dec.2023卜庆龙12,左之才,才冬杰,叶刚,田斌,李伟强,苟丽萍,王娅,邓俊良!(1.四川农业大学动物医学院/动物疫病与人类健康四川省重点实验室,四川成都6 11130;2.山东畜牧兽医职业学院宠物科技学院,山东潍坊2 6 10 6 1)摘要:为建立一种快速准确且便携的检测牛病毒性腹泻病毒(BVD
2、V)的方法,本研究将制备的BVDV单克隆抗体(MAb)作为检测线(T线,以纯化的免源多克隆抗体作为金标蛋白,以羊抗兔IgG-HRP作为质控线(C线),组装成双抗体夹心胶体金层析试纸条,并优化各反应条件。结果显示,最适金标蛋白标记量为30 g/mL,BVD VMAb和羊抗兔IgG-HRP最佳浓度均为0.5mg/mL。利用猪瘟病毒(CSFV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛丘疹性口炎病毒(BPSV)及BVDV临床分离株评估该试纸条的特异性,结果显示,除阳性对照和BVDV临床分离株检测为阳性外,其余病毒均为阴性,表明该试纸条的特异性较强,无交叉反应。将BVDV-NADL株(10 6 6 ELD
3、s/mL)10倍倍比稀释后,利用该试纸条检测,结果显示其最低检出量为10 46 ELDso/mL。利用同一批次和不同批次制备的试纸条对CSFV、IBRV、BPSV、BVD V临床分离株检测,结果显示检测结果均一致,表明该试纸条的重复性良好。将制备的试纸条应用于检测临床采集的6 8 份牛血清样品,并以RT-PCR方法同时检测,结果显示胶体金试纸条对BVDV的阳性检出率为17.5%(12/6 8),RT-PCR对BVDV的阳性检出率为2 6.5%(18/6 8),两者之间的总符合率为88.24%。本研究于国内首次采用双抗体夹心方式制备了检测BVDV的胶体金免疫层析试纸条,该方法方便快捷,特异性及敏
4、感性均较好,适宜于牛场BVDV的快速筛选,为进一步研制BVDV胶体金检测试剂盒提供了实验依据。关键词:牛病毒性腹泻病毒;双抗体夹心;胶体金层析技术;检测;试纸条中图分类号:S852.65文献标识码:A文章编号:10 0 8-0 58 9(2 0 2 3)12-12 53-0 5Development of colloidal gold test strip for rapid detectionof BVDV antigenBU Qing-long2,ZUO Zhi-cai,CAI Dong-jiet,YE Gang,TIAN Bin,LI Wei-qiang,GOU Li-ping,WANG
5、 Ya,DENG Jun-liang(1,School of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University/Sichuan Key Laboratory of Animal Disease and Human Health,Chengdu 611130,China;2.Shandong Animal Husbandry and Veterinary Vocational College,Weifang 261061,China)Abstract:In order to establish a clinical rapid and por
6、table method for the detection of bovine viral diarrhea virus(BVDV),amonoclonal antibody(MAb)against BVDV prepared in our laboratory was used as the T line,the gold-labeled polyclonalantibodies obtained from white rabbit immunized with purified BVDV was used as the standard,and the sheep anti-rabbit
7、HRP-IgG was used as the C line to assemble into a double antibody sandwich colloidal gold chromatography reagent strip and*Corresponding author收稿日期:2 0 2 2-12-11基金项目:国家重点研发计划资助(2 0 2 1YFD1600200);国家现代农业产业技术体系资助(肉牛耗牛,CARS-37);四川省自然科学基金(2 0 2 2 NSFSC1620)作者简介:卜庆龙(1994-),山东济南人,硕士,助教,主要从事中兽医与中兽药研究.*通信作者
8、:E-mail:;d o n g j i e _ c a i s i c a u.e d u.c n;947 112 3 q q.c o m1254中国预防兽医学报2023年optimized the reaction conditions.The results showed that the optimal protein labeling amount was 30g/mL,and the optimalconcentration of the C and T lines was 0.5mg/mL.Serum against swine fever virus(CSFV),bovine
9、infectious rhinotracheitis virus(IBRV)serum,bovine papular stomatitis virus(BPSV)isolate,or BVDV clinical isolate was used to evaluate the specificity of thetest strip.The results showed positive results for the positive control and BVDV clinical isolate,and the rest were negative,indicating that th
10、e specificity of the test strip was strong and there was no cross-reaction.The minimum detection amount of thisstrip is 1046ELDso/mL.The prepared test strips were applied to 34 bovine serum samples collected in clinical practice,and theRT-PCR method was used as the control for comparison.The results
11、 showed that the positive detection rate of colloidal gold teststrips was 17.5%(12/68),and the positive detection rate of RT-PCR was 26.5%(18/68).Thus,the consistency rate between thetwo methods was 88.24%.In this study,the double antibody-based sandwich method was used to prepare BVDV colloidal gol
12、dimmunochromatography test strips for the first time in China,which was convenient and fast,with good specificity and sensitivity,which was suitable for the rapid screening of BVDV in cattle farms.It provided specific techniques for the further development ofBVDV detection kits.Key words:bovine vira
13、l diarrhea virus;double antibody sandwich;colloidal gold chromatography;detection;test strip牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BV D)是由BVD病毒(BVDV)引起牛的急性接触性传染病。患BVD的牛表现为精神沉郁、采食下降、急性出血综合征、泌乳量急剧下降、黏膜病、肠胃炎、腹泻、大量流涎、流产甚至死亡等临床症状2 3。根据BVDV 5非编码区(5 UTR)或者Npro蛋白基因型的不同,该病毒分为BVDV-1型和BVDV-2型,以及新发现的BVDV-3型。BVDV持续性感染(Per
14、sistent in-fection,PI)牛长期携带病毒并排毒是造成该疫病难以控制的主要因素,给全球养殖业造成了重大经济损失。BVDV具有很高的突变率,尤其是其结构蛋白E2极易发生变异,造成疫苗免疫效果不佳。注射疫苗、合理检测、及时淘汰阳性牛是现今防控BVD的主要手段5-。目前检测BVDV的主要方法有病毒的分离与鉴定、电镜观察、免疫荧光和免疫组化、PCR、琼脂扩散试验、ELISA等7-8 。但这些检测方法对人员要求较高,或者操作繁,受限于场地等因素。因此呕需研发一种简单便携、快捷且特异性强的检测方法。利用免疫胶体金层析技术(Colloidal gold im-munochromatograp
15、hic assay,G I CA)制备的检测试纸条具有操作方法简便、安全环保、便携等优点,已广泛应用到多种病原检测中9。但目前为止,我国尚无BVDV抗原胶体金检测试纸条的研究报道。因此,本研究采用双抗体夹心的方式组装检测BVDV抗原的胶体金试纸条,为BVD诊断、BVDV筛查提供简便快速的检测方法。1材料与方法1.1主要实验材料BVDV-1型单克隆抗体(MAb)、多克隆抗体(PAb)均由本研究室制备并保存。BVDV-NADL(BVDV-1)株、BVDV-1b型临床分离株10)、牛丘疹性口炎病毒(Bovine papular stomatitis virus,BPSV)、胎牛血清为实验室保存;猪瘟
16、病毒(Classi-cal swine fever virus,CSFV)、牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV),购自中国兽医药品监察所。胶体金、吸水纸、NC膜、PVC板、金标垫均购自北京吉森生物科技有限公司;pH试纸等均购自成都浩博优科技有限公司。6 8 份牛血清样品采自四川省广安市和邛崃市。1.2PAb最适标记浓度的优化分别于96 孔板中,每孔加入2 0 0 L的pH9.0的胶体金溶液,将PAb溶液用PBS稀释至1mg/mL,然后2 倍倍比稀释至12 8 倍,从第一个孔开始以2 2 L/孔,分别加入8 个孔中,震荡
17、10 min,第9个孔只加2 0 0 L胶体金溶液作为阴性对照,第10 孔加入2 0 0 L胶体金溶液和2 0 L10%NaCl作为阳性对照,除阳性对照外,每孔均加入10%NaCl20L,震荡10 min后静置2 hll。观察颜色变化,第一个保持红色不变时加入PAb的量即为金标记浓度,一般在此基础上增加2 0%用量作为最佳标记浓度。按照最佳标记浓度的PAb,参照文献12制备金标抗体,将处理过的金标垫(金标垫浸入金标垫处理液浸泡30 min,37 烘干)放入重悬液中浸泡30 min,37 烘干,4避光保存。第12 期卜庆龙,等.BVDV抗原胶体金快速检测试纸条的研制12551.3胶体金试纸条各反
18、应条件的优化13,采用方阵法对质控线(C)处羊抗兔IgG-HRP浓度(1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.2 5 mg/mL、0.12 5 mg/mL、0.0625 mg/mL),检测线(T)处BVDV-1 MAb浓度(2 mg/mL、1 m g/m L、0.5 m g/m L、0.2 5 m g/m L、0.125mg/mL、0.0 6 2 5m g/m L)进行优化,分别观察C线和T线显色情况,取能够发生显著颜色反应的浓度为最佳浓度。1.4特异性试验买采用上述优化后的最佳浓度的PAb、I g G-H RP、M A b,按照常规操作组装胶体金试纸条后,检测CSFV、IBRV、BPSV、B
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 病毒性 腹泻 病毒 抗原 胶体 快速 检测 试纸 研制
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。