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难溶性原料药、辅料、制剂细菌内毒素检查方法的研究进展.pdf
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1、中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3273DOI:10.19803/j.1672-8629.20230423 中图分类号:R927.1文献标志码:A 文章编号:1672-8629(2024)03-0273-07基金项目:国家重点研发计划(2019YFC1200704);北京市自然科学基金资助项目(L222010)。作者简介:张晨雪,女,硕士,药品质量控制。为共同第一作者。*通信作者:蔡彤,女,硕士,主任药师,药品质量控制。E-mail:细菌内毒素(LPS)是革兰阴性菌细胞壁的特殊组成部分,作为一种外源性热原,由细菌死亡后释放。
2、如果通过注射等方式进入人体,可以激活中性粒细胞,使之释放出内源性热原物质,引起人的发热症状,严重时甚至会导致人的休克或死亡,所以 LPS检查是注射剂类药物质量控制中重要的检测项目之一。LPS 检查法(BET)又称鲎试剂法,系利用鲎试剂难溶性原料药、辅料、制剂细菌内毒素检查方法的研究进展张晨雪,裴宇盛,蔡彤*(中国食品药品检定研究院化学药品检定所药理室,北京 102629)摘要:目的总结药典及近 10 年相关文献中有关难溶性样品检测方法的建立思路,为难溶性原料药、辅料、制剂的内毒素检查研究提供借鉴。方法重点对药典及国内文献中难溶性样品的内毒素限值确定、检查方法、溶解方法、排除干扰的思路进行详细分
3、析与论述,尤其对有机溶剂的选择重点阐述。结果及结论难溶性样品细菌内毒素检测方法建立的难点在于寻找合适的溶剂及排除干扰,溶解方法考虑有机溶剂、非有机溶剂、物理方法,排除干扰的方法考虑调节pH、补充二价阳离子、使用抗增液、分散剂等思路,以期为后续研究提供思路。关键词:原料药;辅料;制剂;细菌内毒素;鲎试剂;难溶性;方法学;质量安全;排除干扰Research progress in bacterial endotoxin test methods for insoluble raw materials,excipients and preparationsZHANG Chenxue,PEI Yush
4、eng,CAI Tong*(Division of Pharmacology,Institute for Chemical Drug Control,National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 102629,China)Abstract:Objective To summarize the ideas behind test methods established for insoluble samples in the Chinese Pharmacopoeia and related literature in China o
5、ver the past 10 years,and to provide reference for endotoxin detection of insoluble APIs,excipients and preparations.Methods The determination of endotoxin limits,inspection methods,dissolution methods,and strategies for excluding interferences in domestic literature on insoluble samples were analyz
6、ed by focusing on the selection of organic solvents.Results and conclusion The difficulty in establishing a method for the detection of bacterial endotoxin in insoluble samples lies in the search for suitable solvents and the elimination of interferences.Dissolution methods involve organic solvents,
7、non-organic solvents and physical methods,while the elimination of interferences involves the adjustment of pH,the supplementation of divalent cations,and the use of antiproliferative fluids and dispersants.This study is expected to inspire ideas for subsequent research.Keywords:raw materials;excipi
8、ents;preparations;bacterial endotoxin;TAL;insolubility;methodology;quality safety;elimination of interference与细菌内毒素产生特殊凝集反应的机制,以判断供试品中 LPS 含量是否符合规定的方法。由于鲎试剂是水溶性蛋白,因此 LPS 与鲎试剂的反应应在水溶液中进行,但在水中难溶或者不溶的样品,则需经过必要的前处理方可用于检测。随着药学科技水平的发展,难溶性药物(原料药、辅料、制剂)所占比例呈增长趋势。原料药是药品制剂的有效成分,辅料是制剂处方设计中主药以外的一切药用物料,制剂是按照一定剂型
9、要求所制成的最终提供给用药对象使用的药品,对以上 3 种药物的 LPS 控制直接关系到药品的质量控制和临床用药安全。药品质量控制及评价专栏编者按:药品安全的重要性关系着人民群众的身体健康,人们对健康的重视程度不断提升,药品监管部门对药品质量的要求也更加严格。本专栏组织药品检定领域研究人员,通过探讨难溶性原料药、辅料、制剂细菌内毒素检查方法,化学对照品的引湿性,热分析技术等内容,并介绍检测方法在到手香提取物溶剂残留、溴己新注射剂中的应用,保证公众用药安全。中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3274目前,药典及文献均未见对难溶性药
10、物的 LPS检查研究的系统总结,因此本文将现有的难溶性药物的 LPS 检测方法学建立研究进行汇总和分析,为之后难溶性药物的 LPS 检查研究提供参考,并希望能助力药典相关指导原则的修订,以及为难溶性药物的质量控制提供技术支持。建立难溶性药物的LPS 检查方法过程一般为先确定限值及使用的检测方法,然后重点研究合理的前处理溶解方法使难溶性药物完全溶解,让包裹在内部的 LPS 释放出来,并且还要采用适宜的方法排除干扰,最后进行 LPS 含量的检测,从而保证 LPS 检验的准确性和可靠性。1 国内外药典及文献研究现状从药典角度看,中华人民共和国药典(简称“中国药典”)四部通则 1143“细菌内毒素检查
11、法”、9251“细菌内毒素检查法应用指导原则”、9301“注射剂安全指导原则”中有提及 LPS 检查的供试品制备及检验要求1。1143 中收录的供试品溶液的制备,涉及复溶、浸提、调节pH 等,主要针对的是可溶性样品和需浸提后检验的包装材料等。9251在供试品的前处理方法中,重点提及了在水中溶解度低的样品的处理方式“可以采取超声波、加热助溶、添加助溶剂、调节pH 等方法提高其溶解度。当采用适宜的有机溶剂(乙醇、DMSO 等)进行溶解时,必须进行干扰试验验证内毒素的回收”,以及新型制剂“采取适宜方法将包合体破坏,使包裹在内部的细菌内毒素完全释放”的指导意见。9301主要是对限值的设定有较为详细的说
12、明。国外药典则主要参考了美国药典2和欧洲药典3,其中对于难溶性药物的 LPS 检测方法建立均无明确指导。从文献角度看,国内已开展了多种难溶性药物的 LPS 检查法建立的研究,研究范围较广。文献中涉及的原料药包括肿瘤药4-6、抗生素7-11、降血糖药物8、麻醉药12-13、心血管类药14-17、中枢神经类药物18-19等;制剂类包括注射液等普通制剂20-21和微球22-23、脂质体24-25等新型制剂;辅料主要涉及脂类26-29、油类30等。而国外文献相关研究没有查到很多信息,仅对于特殊制剂微球、脂质体类的难溶性样品中 LPS 检查法的建立进行了研究31-32,且思路同国内一致,故在下文进行统一
13、阐述。2 方法建立研究现状2.1 限值的确定中国药典 四部1中规定 LPS 限值计算公式为 L=K/M,L 代表限值,K 为人每千克体重每小时最大可接受的 LPS 剂量(根据给药途径,K 有不同的规定数值),M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量(M 可以参考药品说明书或权威性资料的用法用量)。难溶性制剂的限值与其他药品相同,应先按规定的公式要求计算,如有联合用药时应考虑其他制剂可能引入的 LPS,儿科用药、营养不良用药和恶病质用药等应考虑体弱患者的身体素质,可以在计算值的基础上从严制定,至计算值的1/31/2,以保证安全用药。原料药的限值可参考其制剂的 LPS 限值,也可在此基础上适当严
14、格。对于药用辅料,ZHU 等33对药用辅料 LPS 限值的设定展开了探讨,并提供了设定思路,即可以参考药用辅料在制剂中的占比以及重要程度,从严制定标准。ZHANG 等12研究布比卡因碱,取计算值为限值;GONG 等34研究丁酸氯维地平时,限值取计算值的 1/2;DING 等35研究香菇多糖,HAO 等36研究度骨化醇,均取计算值的 1/3;ZHAO 等18研究多奈哌齐,计算值为 0.67 EUmg-1,最终取值为 0.19 EUmg-1研究抗坏血酸棕榈酸酯,计算值为 2.5 EU mg-1。不同研究人员根据制品的具体情况对限值制定的思考略有不同。2.2 检测方法的选择中国药典 四部1143 项
15、下收录的 LPS 检查法包括凝胶和光度 2 种检测方法,凝胶法可分为凝胶限度试验和凝胶半定量试验 2 种;光度法按照检测原理可分为动态显色法、终点法显色法、动态浊度法和终点浊度法共 4 种方法;故 LPS 检查法共包括 6种方法1(表 1)。其中凝胶法所用的鲎试剂和浊度法所用鲎试剂配方接近,主成分均为鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品,反应原理相近,分别通过凝集反应和浊度变化确定实验结果,干扰试验的结果可以相互借鉴;显色法鲎试剂不同于前两者,配方是鲎血液冻干品与显色基质 11 配制而成,通过生色团的含量测定 LPS 含量,凝胶法和浊度法的干扰试验对其不具有借鉴意义3。应根据样品处理后是
16、否产生浑浊、颜色等情况,以及排除干扰因素所需的稀释倍对应的检测灵敏度或检测范围等,选择适宜的 LPS 检查方法1。2.3 溶解方法的选择难溶性药物的共同特点是在水中不能完全溶解,包括微溶、极微溶解、不溶或几乎不溶。原辅料及制剂均应根据样品的理化性质及干扰试验的结果综合选择相应的溶解方法,溶解方法一般分为采用有机中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3275溶剂溶解、非有机溶剂溶解、物理方法助溶等。2.3.1 有机溶剂 有机溶剂的筛选,需根据已知的样品溶解性选择,若可溶于多种溶剂,可通过考察溶解度、在后续用水稀释中是否产生干扰、实验
17、操作难易程度等情况进行筛选。常用的有机溶剂有乙醇(EtOH)、二甲亚砜(DMSO)、三氯甲烷(CHCl3)、二氯甲烷(CH2Cl2)、甲醇(MeOH)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃、甘露醇等。2.3.1.1 难溶性原料药 原料药是难溶性药物 LPS 检查方法建立的最大类研究对象,对于溶解剂的选择是其研究的重点。LIU 等4研究氟维司群、ZHOU 等16研究丙泊酚、YAN 等5研究 HSSYO-001-3S(喜树碱类衍生物)、XU 等14研究米力农,均选择 DMSO 作为溶剂;CHEN 等38研究丹曲林钠选择 DMF 作为溶剂;ZHANG19研究利培酮选择甲醇作为溶剂。这些都是方法建
18、立研究过程中相对比较简单的案例,仅考虑溶解性选择合适的溶剂而后稀释,便可排除干扰。LIN 等39研究注射用盐酸溴己新原料药,考虑到溶解性和酸碱性,故而通过无水乙醇溶解+调节pH 建立方法。WANG 等7研究他克莫司、WU等15和XU 等16研究丁酸氯维地平,均根据样品的溶解性选择乙醇作为溶解剂,但因样品性质差异所使用的乙醇浓度不同,分别使用了无水乙醇、80%和 60%乙醇。HAO 等36研究度骨化醇,已知其溶于 DMSO也溶于无水乙醇,后续凝胶法干扰实验和光度法回收率实验证明 2 种试剂作为溶剂均对反应体系无干扰,稀释过程也未产生干扰,但因度骨化醇注射液的配方是由乙醇和水组成的,所以最终选择无
19、水乙醇作为溶剂。GONG 等34研究丁酸氯维地平,初步也是选择无水乙醇和 DMSO,后续证明均无干扰,但因DMSO 熔点较低为18.5,低温下易凝固,最后选择无水乙醇作溶剂。CHEN 等26研究胆固醇,选择无水乙醇和 20%正己烷+80%乙醇 2 种溶剂,因后者在稀释过程中出现白色块状物,最后选择无水乙醇作为溶剂。这是面对多种溶剂均可使用时,如何选择适宜溶剂的案例。WU 等6研究硼替佐米,考虑到有机溶解可能产生干扰以及操作简便性,选择制剂工艺的思路,用10%甘露醇作为溶剂。WANG 等40研究硫辛酸,根据企业制备注射液时的处方选择 BET 水+乙二胺作为溶剂;FENG 等41研究三氟甘露糖,同
20、样跟随注射剂制备工艺的思路选择无水乙腈作为溶剂,这提示在进行原料药的研究时,除了考虑溶解性的思路,也可以首先考虑制剂工艺的思路。2.3.1.2 难溶性辅料 有关辅料的研究,ZHOU 等27和 PEI 等28研究蛋黄卵磷脂、CHEN 等26研究胆固醇、WAN 等29研究油酸,分别代表了磷脂类、脂质类、油状类 3 类难溶性物质,根据脂溶性物质的溶解特性以及干扰因素,均主要选择乙醇作为溶剂。其中磷脂类辅料在中国药典中收录的方法即为使用无水乙醇溶解,但在实际应用中出现了LPS 回收率难以达到药典要求的问题;PEI 等28研究的方法在本文4.4 中涉及分散剂的选择,为磷脂类辅料检测提供了更优化的方法。胆
21、固醇在研究中选择无水乙醇和 20%正己烷+80%乙醇 2 种溶剂,因后者在稀释过程中出现白色块状物,最后仍选择无水乙醇作为溶剂。油酸的研究同时考虑了原料药部分中提及的乙醇的干扰作用,最终选择 96%乙醇溶解。2.3.1.3 难溶性制剂 有关难溶性制剂的研究,文献中多为对微粒制剂的研究,中国药典四部1中对微表 1 细菌内毒素检查法比较Table 1 Comparison of bacterial endotoxin test methods检查法优点缺点凝胶限度试验操作简单,成本低,仪器简单(恒温水浴),不需要专用 的 LPS 检测仪或具有动态检测功能的酶标仪,易浑浊、易析出的供试品适宜使用此方
22、法37不能定量,灵敏度仅到 0.03 或 0.015 EUmL-1凝胶半定量试验 同凝胶限度试验,且可半定量不能准确定量,操作复杂,应用较少动态浊度法灵敏度高,检测限范围 100.001 EUmL-1,可进行定量,监测反应全过程试剂昂贵,需要专用的内毒素检测仪或具有动态检测功 能的酶标仪,供试品稀释最终状态为浑浊状态则不宜使 用此方法37动态显色法灵敏度高,检测限范围 500.005 EUmL-1,不依赖凝固蛋 白形成凝胶,抗干扰能力强1试剂昂贵,需要专用的内毒素检测仪或具有动态检测功 能的酶标仪,样品如为有色物质不宜用此方法终点显色法反应时间短,不需要动力学功能的酶标仪或专用内毒素检 测仪操
23、作要求高,相比于动态法检测范围窄,含有色物质的样 品不宜用此方法终点浊度法同终点显色法操作要求高,相比于动态法检测范围窄,供试品稀释最终 为浑浊状态不宜使用此方法,且目前国内外均无商业化 的终点浊度法试剂1中国药物警戒 第 21 卷第 3 期 2024 年 3 月 March,2024,Vol.21,No.3276粒制剂定义为“药物或与适宜载体经过一定的分散包埋技术制得具有一定粒径的微粒组成的制剂”,主要包括脂质体、微球、胶束等,此类制剂进行 LPS检查方法建立的难点是首先要破坏载体将被包裹的LPS 完全释放出来。PEI 等24研究紫杉醇脂质体,发现其 LPS 检测存在 LPS 被困于脂质体可
24、能导致漏检,以及脂质体中存在大量表面活性剂对 LPS 的检测存在影响等问题,最终通过使用乙醇破坏脂质体,或者加水后超声至均匀分散,旋涡混匀后离心取上清液,并用 0.5%白蛋白或其他的分散剂消除干扰;SUN25研究依托泊苷脂质体微球注射剂,选择60%乙醇溶解。关于微球制剂的研究,微球类制剂其辅料和主成分均可被 DMSO 溶解,所以一般首先考虑DMSO,如注射用醋酸奥曲肽22、注射用双羟萘酸帕瑞肽、注射用艾塞那肽微球 3 种制剂的研究23。关于胶束类药物的研究较少,多西他赛聚合物胶束42的方法建立选择碱性溶液破坏聚合物胶束,这与胶束的疏水链特性有关。LUO20研究榄香烯乳状注射液,不属于微粒制剂的
25、范畴,但也需要破坏乳剂将 LPS 完全释放,选择无水硫酸钠破乳并筛选出合适的破乳条件。总的来说,脂质体可以被乙醇破坏,微球可被DMSO 溶解,胶束类尚未有足够多的研究。2.3.1.4 萃取法 有机溶剂溶解然后结合萃取提取的方法,相较于上述直接溶解的方法而言更为复杂。一般使用的有机溶剂为密度比水大的溶剂,以使水层在上层便于实验,常用溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷等。操作思路为:样品用有机溶剂溶解后,加入等体积 LPS 检查用水漩涡混匀萃取 30 s 以上,离心后取上清液作为供试品溶液。有关原料药的研究,ZHANG 等43研究-3 脂肪酸甘油三酯,选择三氯甲烷;CHEN 等44研究精制鸦胆子油,直接用水
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