美味牛肝菌子实体三个生长发育阶段转录组分析.pdf
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1、13昭 通 学 院 学 报第 45 卷 第 5 期Vol.45 No.5Journal of Zhaotong University2023 年 10 月Oct.2023高原特色农业研究美味牛肝菌子实体三个生长发育阶段转录组分析郭磊,李为兰,资璐熙,徐柠檬,韩龙(西南林业大学 云南省高校大健康类森林资源开发利用工程研究中心,云南 昆明 650224)摘要:明确美味牛肝菌子实体不同生长发育阶段的基因表达情况,探讨其生长发育过程的品质变化机制。对美味牛肝菌幼嫩子实体、开伞前的成熟子实体及开伞后的成熟子实体及不同组织(菌盖和菌柄)进行转录组测序,对各数据库的基因进行功能注释,对差异表达基因也进行了
2、GO 功能和 KEGG 富集分析。GO功能显示了美味牛肝菌开伞前的子实体菌柄和开伞后的成熟子实体菌柄间的差异表达基因主要富集在酮酸代谢、有机酸代谢、羧酸代谢及天冬氨酸家族氨基酸代谢与合成等,它们协同调控为子实体成熟过程中菌柄的生长发育提供稳定的内部环境。KEGG 分析表明差异表达基因在 2-氧代羧酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等氨基酸的合成中被富集,为美味牛肝菌子实体的生长发育提供重要的营养与能量。通过转录组分析发现了美味牛肝菌子实体 3 个不同生长发育阶段的差异表达基因,为阐释美味牛肝菌子实体生长发育的分子机理奠定一定的理论基础。关键词:美味牛肝菌子实体;
3、生长发育;转录组;差异表达基因中图分类号:S567.3文献标志码:A文章编号:2095-7408(2023)05-0013-08收稿日期:2023-08-11基金项目:云南省科技厅基础研究计划项目(202101AT070042);云南省科技厅农业联合专项(202101BD070001-054)。作者简介:郭 磊(1981),男,河南卢氏人,副教授,博士,硕士研究生导师,主要从事食用菌资源开发与利用研究。0 引言美味牛肝菌(Boletus edulis Bull.:Fr.)属牛肝菌科(Boletaceae)牛肝菌属(Boletus),因外形酷似牛肝而得名,号称“牛肝菌之王”,具有十分重要的生态和
4、经济价值1-2。美味牛肝菌广泛分布于亚洲、北美洲、欧洲及拉丁美洲,而中国是美味牛肝菌的主产区,主要分布于云南、贵州、四川、西藏等森林资源富集区3。美味牛肝菌不仅富含铜、铁、锰、锌等多种矿物质元素和 B 族维生素、抗坏血酸和生育酚等多种维生素,还含有多酚类、多糖及萜类等多种天然活性物质,具有抗肿瘤、抗炎及提高免疫力等多种生理功效4-8。目前,关于美味牛肝菌的研究多集中在液态发酵培养、子实体风味物质分析及生物活性物质提取等方面9-11,对于美味牛肝菌子实体生长发育的分子机理研究薄弱,特别是美味牛肝菌子实体不同生长发育阶段的转录组比较分析未见报道。转录组(transcriptome)最早是由VELC
5、ULESCU 等12在 1997 年对酵母菌基因表达进行研究时首次提出的,是研究复杂生物学通路和性状调控网络分子机制的学科13。目前,转录组测序技术(RNA-seq)已经在生物前沿研究,特别是在大型真菌的基础研究领域有着广泛的应用。储婷等14对香菇未转色菌丝、光照及黑暗条件下菌丝进行转录组测序,共鉴定出 2215 个差异表达基因,通过 GO 富集分析得出差异表达基因在碳水化合物代谢、氧化还原酶活性及水解酶活性过程中明显富集。YAN 等15对正常香菇子实体菌盖、异常子实体菌盖的正常边缘、异常子实体菌盖的异常边缘进行转录组测序后发现,与正常子实体菌盖相比,异常子实体菌盖的异常边缘的细胞壁合成代谢更
6、活跃,增强了真菌的环境适应性。温雪菲等16对人工种植的松茸子实体进行转录组测序并基于 GO 和 KEGG数据库的注释和分析,结果表明在松茸子实体中涉及 unigene 数量最多的生理过程包括碳水化合物代谢、运输和分解代谢、氨基酸代谢等。LIU 等17对灵芝子实体 5 个不同发育阶段进行转录组功能注释后发现富集的途径与氨基酸代谢和碳水化合物代谢有关,与不同发育阶段转换相关的高表达 unigenes包括编码疏水蛋白、细胞色素P450s、胞外蛋白酶等。ZHAO 等18通过转录组学分析了冬虫夏草菌丝、菌核和原基 3 个生长阶段差异表达基因的功能,结果14第 45 卷昭 通 学 院 学 报2023 年(
7、总第 210 期)表明原基中 DNA 合成和细胞分裂活跃,菌丝体的功能是吸收环境中的某些物质。RNA-seq 能够在较短的时间里了解细胞中基因的转录情况及转录调控规律,但在美味牛肝菌子实体生长发育过程中的作用仍有待阐明。本研究对美味牛肝菌子实体三个生长发育阶段(幼嫩子实体、开伞前子实体及开伞后的成熟子实体)及不同组织(菌盖和菌柄)进行转录组测序,以期发现与子实体生长成熟相关的基因,为美味牛肝菌生长发育过程的分子机制提供一定的科学参考。1 材料与方法1.1 材料新鲜美味牛肝菌子实体于 2022 年 9 月采自云南曲靖马龙,收集包括 3 个生长发育阶段的幼嫩子实体菌盖和菌柄、开伞前成熟的子实体菌盖
8、和菌柄、开伞后的成熟子实体菌盖和菌柄等6个样品,每个样本做 3 个生物学重复。样品处理后液氮速冻并保存于-80 备用。1.2 方法1.2.1 RNA 提取总 RNA 提取方法按照试剂盒说明书进行。通过琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 降解程度,通过Nanodrop 微量分光光度计及 Agilent 2100 检测 RNA的纯度(OD260/280)、浓度及完整性,待 RNA检测合格后进行测序。1.2.2 cDNA 文库构建及测序检测合格的 RNA 委托北京擎科生物科技有限公司进行转录组测序,包括 cDNA 文库构建、转录组测序、数据处理及质量控制等,具体参照储婷等14方法进行。美味牛肝菌无参考基因组
9、,在获得 RNA-seq 高质量测序数据后,采用 Trinity19对 clean reads 进行拼接,拼接得到的转录本序列使用 python 脚本提取最长的转录本作为该样品的unigene 进行后续分析。1.2.3 基因表达分析及差异表达基因筛选采用 FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)统计 6 个样本中所有基因的表达量。使用 DESeq20对两个样品间的差异表达基因分析,以 Fold Change 2 且 FDR0.01为阈值筛选两个样品之间表达水平显著差异的基因。1.2.4 差异表
10、达基因 GO 和 KEGG 分析采用BLAST软件对差异表达基因进行GO(Gene Ontology)富集分析,以及在 KEGG(the database of Kyoto encyclopedia of genes and genomes)进 行 注释,进而分析差异表达基因所在的 Pathway21。以 P valueQ30)的碱基占总碱基的比例均高于 92.5%,结果见表 3,6 个样品的 reads 与参考基因组的比对效率在 69.69%73.45%。表 1 测序数据分析样品原始数据 reads 数过滤后 reads 数匹配片读数匹配读段GC 含量Q20 比例 Q30 比例SampleT
11、otal ReadsClean ReadsMapped ReadsMapped Reads/%GC Content%Q20%Q30YFP40186000395927223595592072.2753.0197.4893.0%YFS46013470453746643706373873.3053.2297.3292.65POP41258736408432543427714970.4053.1597.6593.33POS40299502397250803620679173.4553.3897.5693.16MFP41586054410440143314236169.6953.2397.6693.37
12、MFS41837868412701504052933072.2953.0597.4392.88注:YFP:幼嫩子实体菌盖(pileus of young Boletus edulis);YFS:幼嫩子实体菌柄(stipe of young Boletus edulis);POP:开伞前的子实体菌盖(pileus of Boletus edulis before pileus opening);POS:开伞前的子实体菌柄(stipe of Boletus edulis before pileus opening);MFP:开伞后的成熟子实体菌盖(pileus of mature Boletus
13、edulis after pileus opening);MFS:开伞后的成熟子实体菌柄(stipe of mature Boletus edulis after pileus opening),下同15第 5 期美味牛肝菌子实体三个生长发育阶段转录组分析郭磊,李为兰,资璐熙,等Trinity 组装后共有转录本 179191 条,Unigene有 82884 个,占总转录本数的 46.26%,其中序列长 度 在 200-500 bp 的 Unigene 有 35140 条,500-1000 bp的有22542条,1000-2000 bp的有16543条,大于 2000 bp 的有 8659 条
14、,呈现 Unigene 长度变短而转录本数增加的趋势,但转录本数量在 1000-2000bp 时的增长幅度不明显(图 1),进一步说明美味牛肝菌子实体在生长发育过程中的基因表达异常活跃。图 1 拼接 Unigene 与转录本长度的分布2.2 Unigene 的功能注释从 Nr、Pfam、eggNOG、Swiss-prot、gene ontology blast、KEGG、tmhmm、Signal 和 CAZy共 9 组 数 据 库 注 释 的 Unigene 来 看,在 1702-23425 内 Nr 数 据 库 中 的 Unigene 数(23425)最多,占 21.63%,Pfam 数 据
15、 库(20274)其 次,占 18.72%,而 CAZy 数 据 库(1702)中 获 得 的Unigene 数最少,只占 1.57%(图 2)。表 2 数据库基因注释成功率统计2.3 Unigene 功能分类2.3.1 GO 分类成功注释的基因按照 GO 分类分为生物学过程 BP(biological process)、细胞组分 CC(cellular component)和分子功能 MF(molecular function)3 大类(图 3),其中 BP 涉及 25 个功能,比例最高的 3 个功能分别是细胞进程(cellular process)、新陈代谢进程(metabolic pro
16、cess)和生物调节(biological regulation),基因比例最低的 3 个功能分别是碳源利用(carbon utilization)、细胞杀伤(cell killing)和细胞聚集(cell aggregation)。CC 涉及 20 个功能,其中基因比例最高的 3 个功能分别是细胞(cell)、细胞元件(cell part)及细胞器元件(organelle part),基因比例最低的 3个功能分别是病毒粒子元件(virion part)、病毒粒子(virion)和别的细胞器元件(other organism part)。MF 涉及 15 个功能,其中基因比例最高的 3 个功能
17、分别是细胞结合(binding)、催化活性(catalytic activity)及转录子活性(transporter activity),基因比例最低的 3 个功能分别是操纵分子功能(hijacked molecular function)、毒素活性(toxin activity)和转录子调节活性(transcription regulator activity)。图 3 美味牛肝菌子实体 3 个生长发育阶段共同差异表达基因的 GO 富集分析2.3.2 COG 分类将注释成功的基因 COG 分类成 24 组,结果见图 4,其中比例最大的 3 个功能分别是转译后修饰、蛋白周转、分子伴侣(pos
18、ttranslational modification,protein turnover,chaperones),未知功能(functional unknown),及碳水化合物转运与代谢(carbohydrate transport and metabolism),比例最小的 3 个功能分别是细胞迁移(cell motility)、细 胞 外 结 构(extracellular structures)及 核 结 构(nuclear structures)。16第 45 卷昭 通 学 院 学 报2023 年(总第 210 期)图 4 美味牛肝菌 6 个样本共同表达基因的 COG 分类2.3.3
19、KEGG 分类将 KEGG 代谢通路分为细胞过程(cellular processing)、环 境 信 息 处 理(environmental information processing)、遗传信息处理(genetic information processing)、代 谢(metabolism)及有机体系(organismal system)等 5 个分支,结果见图 5。5 个分支中遗传信息处理占比最高,有机体系占比最低。遗传信息处理中碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)占比最高,接着是氨基酸代谢(amino acid metabolism)和脂质代谢(lipi
20、d metabolism),而萜类化合物和聚酮的代谢(metabolism of terpenoids and polyketides)占比最低。美味牛肝菌的风味物质主要由呈香味的挥发性八碳化合物和呈滋味的氨基酸组成,而碳水化合物代谢、氨基酸代谢和脂质代谢也和美味牛肝菌生长发育过程中风味物质的形成一致。图5 美味牛肝菌6个样本共同表达基因的KEGG富集分析2.4 不同生长发育阶段的差异表达基因分析对美味牛肝菌子实体相邻发育阶段及同阶段不同组织间的差异表达基因进行分析,结果如图 6 所示。对 7 组差异基因数据库进行分析,获得上调基因 45974 个和下调基因 47169 个。POS-VS-MF
21、S 间 DEG 最多,约占香菇注释基因总数的21.5%。在 POP-VS-MFP、POS-VS-MFS、YFP-VS-YFS、POP-VS-POS 间 DEG 数 量 均 超 过 了17000 个,在 YFP-VS-POP、YFS-VS-POS 以 及MFP-VS-MFS 间 DEG 均少于 8000 个。这说明基因的表达在发育期间具有时空特异性,并且从开伞前的子实体菌柄到开伞后的成熟子实体菌柄间的转变是最复杂的过程。图 6 美味牛肝菌相邻发育阶段及同一阶段不同组织间差异表达基因数量2.5 差异表达基因 GO 功能富集分析开伞前的子实体菌柄和开伞后的成熟子实体菌柄间的互比差异表达基因被分为 B
22、P、CC 和MF 3 大类(图 7),有机酸代谢和氨基酸代谢是美味牛肝菌风味形成的重要途径,可以看出酮酸代谢(oxoacid metabolic)、有机酸代谢(organic acid metabolic)、羧 酸 代 谢(carboxylic acid metabolic)、天冬氨酸家族氨基酸代谢(aspartate family amino acid metabolic)和天冬氨酸家族氨基酸合成(aspartate family amino acid biosynthesis)编码基因在开伞前的子实体菌柄上调表达,说明这些基因在美味牛肝菌子实体开伞前的菌柄形成过程中具有重要的调控作用。图
23、7 还反映出 DEG 富集在真菌型液泡膜(fungal-type vacuole membrane)、真菌型液泡(fungal-type vacuole)、真菌型细胞壁(fungal-type cell wall)、有机环状化合物结合(organic cyclic compound binding)、杂环化合物结合(heterocyclic compound binding)、催化活性17第 5 期美味牛肝菌子实体三个生长发育阶段转录组分析郭磊,李为兰,资璐熙,等(catalytic activity)、氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)、单加氧酶活性(monoo
24、xygenase activity)等。图 7 开伞前的子实体菌柄和开伞后的成熟子实体菌柄差异表达基因 GO 功能分类:(a)(c)和(e)上调表达;(b)(d)和(f)下调表达;P-value 为多重假设检验校正后的 P 值;DEG number 为差异基因数18第 45 卷昭 通 学 院 学 报2023 年(总第 210 期)2.6 差异表达基因 KEGG 富集分析对开伞前及开伞后成熟子实体菌柄间的差 异 表 达 基 因 进 行 KEGG 富 集 分 析,结 果 表明 DEGs 主要富集在氨基酸合成(biosynthesis of amino acids)、2-氧代羧酸代谢(2-oxoca
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