猫杯状病毒HRB-SS株感染性cDNA克隆的构建与病毒的拯救.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 10 期2023 年 10 月Vol.45,No.10Oct.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202303019猫杯状病毒HRB-SS株感染性cDNA克隆的构建与病毒的拯救孙伟尧1,宋海军2,刘春国1,杨德成1,王靖飞1*(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 动物疫病防控全国重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150069;2.张家口市动物疫病预防控制中心,河北 张家口 075000)摘要:为构建猫杯状病毒(FCV)HRB-SS株的感染性
2、克隆,本研究合成3端含有丁肝病毒核酶(HdvRz)序列的HRB-SS株全长基因组序列,将该序列插入pOK12-CMV载体,获得含FCV HRB-SS全长基因组cDNA克隆的重组质粒pFCV-HRB-SS。将重组质粒pFCV-HRB-SS转染猫肾细胞(CRFK),48 h即可观察到典型细胞病变,将病变细胞的上清接种未感染的CRFK细胞进行传代培养,连续传5代,从感染的细胞上清中获得拯救病毒。采用FCV VP1蛋白MAb,经间接免疫荧光试验检测,结果显示拯救病毒与亲本病毒均可观察到特异性绿色荧光,而未感染病毒的对照组细胞无荧光信号;各组细胞负染色后经电镜观察均可见病毒粒子呈典型的杯状结构。提取拯救
3、病毒和亲本病毒基因组RNA,反转录为cDNA作为模板,经RT-PCR扩增、I酶切鉴定及测序分析,结果显示,拯救病毒含C5724G位点突变的分子标记,消除了I酶切位点,不同于亲本病毒。上述结果表明获得拯救病毒rFCVHRB-SS。采用蚀斑形成试验和绘制病毒的一步生长曲线进一步检测rFCV HRB-SS,结果显示,rFCV HRB-SS与亲本病毒具有一致的复制水平和体外生长能力。本研究利用真核启动子构建的FCV HRB-SS株全长感染性cDNA克隆系统可直接在细胞内转录,减少了体外操作流程,有效防止了操作污染,具有操作简便,拯救效率高的优势,为后续FCV基因功能的研究和新型疫苗的研发奠定了基础。关
4、键词:猫杯状病毒;感染性cDNA克隆;反向遗传操作系统中图分类号:S852.65文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)10-1080-05Construction of an infectious cDNA clone of FCV HRB-SS strainand virus rescueSUN Wei-yao1,SONG Hai-jun2,LIU Chun-Guo1,YANG De-cheng1,WANG Jing-fei1*(1.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention/Harbin Ve
5、terinary Research Institute,Chinese Academy of AgriculturalSciences,Harbin 150069,China;2.Zhangjiakou Center for Animal Disease Control and Prevention,Zhangjiakou 075000,China)Abstract:To establish a reverse genetic platform for feline calicivirus(FCV),the full-length genome of FCV HRB-SS strainwas
6、chemically synthesized with hepatitis D virus ribozyme(HdvRz)sequence inserted at the 3 end.The synthesized virus genomewas cloned into the vector pOK12-CMV to obtain the recombinant plasmid pFCV-HRB-SS,which was transfected intoCrandell-Rees feline kidney(CRFK)cells for virus rescue.Typical cell cy
7、topathic effect(CPE)was observed until 48 hours aftertransfection of the recombinant plasmid pFCV-HRB-SS into CRFK cells.The supernatant from the cytopathic cells was serially收稿日期:2023-03-13基金项目:兽医生物技术国家重点实验室自主研究课题(SKLVBP202121)作者简介:孙伟尧(1993-),男,吉林通化人,博士研究生,主要从事猫杯状病毒侵入机制相关研究.*通信作者:E-mail:*Correspond
8、ing authorpassaged for five generations in CRFK cells,and the rescued virus was obtained from the supernatant of the infected cells.Anindirect immunofluorescence test detected the virus using an MAb against the FCV VP1 protein.The results showed that specificgreen fluorescence could be observed in b
9、oth the rescued and parental viruses.In contrast,the cells in the control group withoutvirus infection had no fluorescence signal.The cells in each group were negatively stained and observed under an electronmicroscope.Virus particles,which have a typical cup-shaped structure,can be observed.The res
10、cued and parental viruses genomeRNA was extracted to perform RT-PCR amplification,I digestion,and sequence analysis.The results showed that the rescuedvirus carries a molecular marker with a C5724G point mutation,which abolishes theI restriction site and is distinct from theparental virus.It was sho
11、wn that the virus was successfully rescued and named rFCV HRB-SS.The plaque formation test andone-step growth curve showed that rFCV HRB-SS exhibited replication and growth ability similar to the parental strain.Thepresent study utilized a eukaryotic promoter-based FCV HRB-SS strain full-length cDNA
12、 infectious clone system,which allows fordirect intracellular transcription,reduces operational steps,effectively prevents operational contamination,and has the advantagesof easy operation and high rescue efficiency.This system provides a foundation for subsequent FCV gene function studies and thede
13、velopment of novel vaccines.Key words:feline calicivirus;infectious cDNA clone;reverse genetics operating system猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)是杯状病毒科()水疱疹病毒属()的一员1。该病毒为无囊膜RNA病毒,具有约7.5 kb的单股正链RNA基因组,其衣壳为直径27 nm40 nm 的正二十面体2。FCV基因组5端通过共价键连接VPg蛋白,3末端具有Poly(A)尾巴结构。该病毒基因组包含3个开放阅读框(Open reading frame,ORF),编
14、码由一个前体蛋白切割而成的6个非结构蛋白(NS1NS6/7)和2个结构蛋白VP1和VP23-4。FCV主要感染不满一岁的猫,也可以感染其他大型猫科动物,如老虎、猎豹和狮子5。大部分患病猫表现为鼻炎、结膜炎和口腔溃疡,而有些猫感染较强病毒株会出现严重急性致命的全身性症状和流行性出血热样症状6。自1957年首次分离鉴定FCV以来,该病毒在美洲、欧洲、亚洲都有发现,目前已呈世界性分布7-8。该病毒的流行较为普遍,中国杭州市调查发现约40%的猫呈FCV血清学阳性9。而在意大利米兰调查发现约有85.4%的猫呈FCV血清学阳性10。FCV疫苗大多数仅能提供部分保护11。目前,利用反向遗传操作技术构建重组病
15、毒为研发具有更好保护力的FCV疫苗成为新的思路。但大多数针对FCV的反向遗传平台都是通过将带有该病毒基因组的质粒酶切线性化,再利用体外转录方式生成该病毒的RNA后在5端加帽,然后转染细胞来病毒拯救12-14。该方法操作繁琐,且易造成RNA的降解。Abente等通过将FCV cDNA导入含噬菌体T7 RNA 聚合酶的细胞中拯救病毒,减少了体外转录和加帽这一过程,简化了操作流程15。国内外已有研究人员利用真核启动子构建了FCV感染性cDNA克隆,通过将其直接转染细胞的方式拯救病毒粒子,进一步简化了操作流程,但是在转染细胞后连续盲传3代才出现细胞病变(CPE),效率较低16-17。为了建立高效方便的
16、FCV基因组反向遗传操作系统,本研究合成了3端含有丁肝病毒核酶(Hepatitis delta ribozyme,HdvRz)序列的HRB-SS株全长基因组,并克隆至含有CMV启动子的载体中,构建了稳定遗传的FCV感染性cDNA克隆并拯救重组病毒,进一步分析其生物学特性,为深入研究FCV基因组结构和功能、致病机制以及新型疫苗的研发奠定了基础。1材料与方法1.1主 要 实 验 材 料猫 肾 细 胞(CRFK)、FCVHRB-SS 株(KM016908.1)、重 组 质 粒 pOK12-CMV、FCV VP1蛋白单克隆抗体(MAb),均由本实验室分离鉴定并保存;大肠杆菌DH5琢感受态细胞、Prim
17、e-ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeSTAR HSDNA Polymerase,均购自TaKaRa公司;Alexa Fluor488标记的山羊抗鼠IgG购自Thermo Fisher Scientific公司;限制性内切酶I购自NEB公司;Simply Ptotal RNA extraction kit购自BioFlux公司;Polyethylen-imine Transfection Reagent购自Sigma-Aldrich公司。孙伟尧,等.猫杯状病毒 HRB-SS 株感染性 cDNA 克隆的构建与病毒的拯救第 10 期10811.2
18、全长cDNA克隆质粒的合成及病毒的拯救本研究设计HRB-SS株全基因组cDNA序列,该序列在HRB-SS株病毒基因组3末端加入30 nt长度的腺嘌呤,并在腺嘌呤后引入具有精确自我剪切功能的HdvRz序列。在病毒基因组5 724 nt处将C突变为G,使该位置GGTACC(I)变为GGTACG,从而消除I酶切位点作为拯救病毒的分子标记。由北京六合华大基因科技有限公司合成该序列后克隆 至pOK12-CMV载体中,获得含有正确HRB-SS株基因组全长cDNA的重组质粒,命名为pFCV-HRB-SS。将重组质粒pFCV-HRB-SS转染生长至80%90%单层的CRFK细胞。转染6 h后更换为含5%胎牛血
19、清的DMEM培养基继续培养,观察CPE,大约2 d收获细胞上清,并在CRFK细胞中连续传5代,收获每一代的细胞上清检测,收获第5代的细胞上清为拯救病毒上清。试验同时设不接种病毒的CRFK细胞为对照组,接种亲本病毒FCV HRB-SS株的CRFK细胞为亲本病毒组。1.3拯救病毒的间接免疫荧光(IFA)检测及电镜观察将第5代拯救病毒上清与亲本病毒FCV HRB-SS株分别接种CRFK细胞,继续培养4 h后弃去培养基,加入4%多聚甲醛固定10 min,PBS洗3次;用含0.1%Triton X-100的PBS透膜20 min,PBS洗3次;用含1%BSA的PBS封闭45 min;加入FCV VP1蛋
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