苦瓜McPDS基因克隆及CRISPR_Cas9基因编辑载体构建.pdf
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1、中中 国国 瓜瓜 菜菜2024,37(3):20-27试验研究苦 瓜 是 葫 芦 科(Cucurbitaceae)苦 瓜 属(Mo-mordica charantia L.)一年生攀缘草本植物,广泛分布在热带、亚热带和温带地区1-3。苦瓜药膳兼用,富含维生素、膳食纤维、粗蛋白、氨基酸等营养物质和皂苷、酚类、类黄酮、多糖等化合物4,具有降糖、降脂、抗病毒、防衰老等多种药理作用5-6,深受广大消费者青睐,市场前景广阔。八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)是类胡萝卜素合成途径中的关键限速酶,与-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)和类胡萝卜素异构酶(CRTISO)共同催化八
2、氢番茄红素合成番茄红素,影响番茄红素及下游类胡萝卜素的生成7-8。PDS收稿日期:2023-11-27;修回日期:2024-01-12基金项目:广东省农业科学院协同创新中心项目(XTXM202203);广州市科技计划项目(202206010170,202201010493);广东省自然科学基金项目(2022A1515010343);广东省农业农村厅种业振兴行动专项(2022-NPY-00-027);广东省农业科学院创新基金项目(202301);广东省农业科学院学科团队建设项目(202130TD)作者简介:韩鑫,女,在读硕士研究生,主要从事蔬菜遗传育种研究。E-mail:通信作者:张长远,男,研
3、究员,主要从事蔬菜遗传育种研究。E-mail:苦瓜 McPDS 基因克隆及 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建韩鑫1,2,郭金菊1,张惠尧1,吴廷全1,张长远1(1.广东省农业科学院设施农业研究所广州510640;2.华中农业大学园艺林学学院武汉430070)摘要:以苦瓜八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因为靶标,构建其特异 gRNA 的 CRISPR/Cas9 基因编辑载体,以期为建立苦瓜 CRISPR/Cas9 基因编辑技术体系奠定基础。以苦瓜自交系 B07 叶片 cDNA 为模板,同源克隆苦瓜 McPDS 基因 CDS 序列。结果表明,McP
4、DS 基因 CDS 序列全长 1731 bp,编码 576 个氨基酸,蛋白质相对分子质量为 64.44 kD,理论等电点(PI)为 7.09。跨膜结构分析结果表明,该蛋白为亲水性非跨膜蛋白。系统进化树分析结果表明,McPDS 与黄瓜、甜瓜等葫芦科植物中的 PDS 蛋白同源性较高。此外,以 McPDS 为靶标基因,在 5 端筛选 2 个高特异性靶点,经设计引物,成功构建 1 个双靶点 CRISPR/Cas9 基因编辑载体,为苦瓜基因编辑体系的建立奠定了技术基础。关键词:苦瓜;McPDS;基因克隆;载体构建;基因编辑中图分类号:S642.5文献标志码:A文章编号:1673-2871(2024)03
5、-020-08Cloning and CRISPR/Cas9 gene editing vector construction of McPDS inbitter gourd(Momordica charantia L.)HAN Xin1,2,GUO Jinju1,ZHANG Huiyao1,WU Tingquan1,ZHANG Changyuan1(1.Institute of Facility Agriculture,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou 510640,Guangdong,China;2.Collegeof
6、 Horticulture&Forestry Sciences,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,Hubei,China)Abstract:A gRNA-specific CRISPR/Cas9 gene editing vector targeting phytoene dehydrogenase(PDS)gene of bittergourd was constructed,hoping to lay a foundation for the establishment of CRISPR/Cas9 gene editing tec
7、hnology systemof bitter gourd.In this study,the CDS region of McPDS gene was cloned from the leaf cDNA of bitter gourd inbred lineB07.The results showed that the coding region length of McPDS was 1731 bp,encoded 576 amino acids,the theoreticalrelative molecular weight was 64.44 kD,and the theoretica
8、l isoelectric point(PI)was 7.09.The transmembrane structureanalysis showed that the protein was a hydrophilic non-transmembrane protein.Phylogenetic analysis showed thatMcPDS had high homology with PDS proteins in cucurbit plants such as cucumber and melon.In addition,using McPDSas the target gene,t
9、wo highly specific targets were screened at the 5 end,primers were designed,and a double-targetCRISPR/Cas9 gene editing vector was successfully constructed,which laid a technical foundation for the establishment ofbitter gourd gene editing system.Key words:Bitter gourd;McPDS;Gene cloning;Vector cons
10、truction;Gene editingDOI:10.16861/ki.zggc.202423.074220第3期,等:基因编辑载体构建试验研究基因编码的蛋白主要位于叶绿体的类囊体膜上,对叶绿体具有光保护作用,其功能的缺失会导致叶绿素降解,造成光漂白现象9。由于该表型明显,易于观察,PDS 基因常被用作报告基因,建立病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系和基因编辑技术体系等,对基因功能研究和作物遗传改良具有重要意义10。CRIPSR/Cas9 系统是新近发展起来的一种高效、精准的基因组编辑技术,已成功应用于拟南芥、烟草和水稻等多个物种中,实现了基因定向编辑11。目前该技术正在被广泛应用于植物基因
11、功能鉴定和品种改良等领域,具有广阔的应用前景。Zeng 等12利用 CRIPSR/Cas9 系统对水稻的 PIN5b、GS3 和 MYB30 基因同时进行定点突变,获得的突变体分别表现出穗长增加、粒径增大和耐寒性增强等特点。Santosh 等13利用 CRISPR/Cas9 方法在籼稻 CV.MTU1010 基因组中创建了突变等位基因DST184-305,该基因有助于提高籼稻品种的耐旱耐盐性和产量。在番茄中,通过 CRISPR/Cas9 技术敲除SP5G、SlMYB12、AGL6 等基因,可使果实产量快速提升14、高效获得粉红果色番茄15和无籽果实16。马存发等17利用 CRISPR/Cas9
12、 技术敲除青花菜的BoSP11 基因,创制了花期自交亲和材料。目前,利用 CRIPSR/Cas9 系统对苦瓜基因进行定点编辑的研究还未见报道。笔者以苦瓜自交系B07 叶片为试材,采用 RT-PCR 技术同源克隆苦瓜McPDS 基因,对其编码蛋白的理化性质、结构特征及保守结构域等进行分析,并以该基因为靶标,利用 CRIPSR/Cas9 系统构建双靶点基因编辑载体,以期为苦瓜基因编辑体系的建立及农艺性状的定向改良奠定技术基础。1材料与方法1.1试验材料本试验所用植物材料 B07 是由广东省农业科学院设施农业研究所选育的高世代、大顶类型苦瓜自交系,于 2023 年 3 月下旬种植于广东省农业科学院白
13、云试验基地,常规管理。于幼苗四叶一心时,取其嫩叶立即放入液氮速冻,并于-80 冰箱保存备用。植物总 RNA 提取试剂盒 SV Total RNA Isola-tion System Kit(Promega,美国),反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Kit(TaKaRa,日本),DNA 凝胶回收试剂盒(TIANGEN,德国),pMD-19T Vector、T4DNA 连接酶(TaKaRa,日本),限制性内切酶 BsaI(NEB,美国),质粒小提中量试剂盒(TIANGEN,德国),大肠杆菌 DH5、根癌农杆菌 GV3101 均购自天根生化科技(北京)有限公司。1.2McPDS基因克隆提
14、取苦瓜叶片总 RNA,反转录合成 cDNA。利用 Primer Premier 5.0 设计 McPDS 基因序列特异性引物,引物序列如下:McPDS-F:ATGTCACTATGT-GGATCTGTCTCTG;McPDS-R:TCACCGAAC-GCCCGCCTCAGC。PCR 反应体系(20 L):Prime-STAR Max Premix(2X)10 L,引物 McPDS-F/R(10 molL-1)各 0.5 L,模板(cDNA)1 L,ddH2O补足至 20 L。PCR 扩增程序:94 3 min;94 1 min,58 45 s,72 1 min,30 个循环;72 延伸4 min。
15、PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后,切胶、纯化回收目的片段。目 的 片 段 加 A 尾 后 连 接 至 克 隆 载 体pMD19-T。连接反应体系及条件:pMD19-T Vector1 L,目的片段 4 L,Solution5 L,16 连接30 min。采用热激法将重组载体转化至大肠杆菌DH5 感受态细胞,涂布于含 100 mgmL-1氨苄青霉素的 LB 固体培养基上,37 倒置培养 16 h,筛选到的阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。1.3McPDS蛋白生物信息学分析利 用Protparam(http:/web.expasy.org/prot-param/)在线分析 M
16、cPDS 蛋白的理化性质;利用ProtScale(http:/web.expasy.or g/protscale/)对 McP-DS 蛋白进行亲水性分析;通过在线软件 NCBI-CDS(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析 McPDS 蛋白的保守结构域;利用 TMHMM2.0 Server(TMHMM 2.0-DTU Health Tech-Bioin-formatic Services)分析 McPDS 蛋白跨膜结构;通过Signal P 4.1 Server(SignalP 4.1-DTU Health Tech-Bi
17、oinformatic Services)预 测 McPDS 蛋 白 信 号肽;分别 利 用 PRABI(npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和Swiss-Model(Swissmodel.expasy.org)预测 McPDS蛋白的二级和三级结构;采用ClustalW和MEGA-X软件进行氨基酸多序列比对及系统进化树 构 建。1.4CRISPR/Cas9基因编辑载体构建1.4.1gRNA 靶点选择和靶标引物设计利用在线网站 CRISPOR(http:/ 2 个靶位点,序列分别为:靶标 1:
18、GGAGAACAGCATCTCHAGGTTGG;靶 标2:韩鑫,等:苦瓜McPDS基因克隆及CRISPR/Cas9基因编辑载体构建21中国瓜菜第37卷试验研究AAAGTAGTGATCGCTGGTGCAGG。根 据 靶 点序 列 合 成 相 应 的 靶 点 引 物,序 列 如 下:CrM-cPDS-F:CAGTGGTCTCATGCAGGAGAACAG-CATCTCGAGGT;CrMcPDS-R:CAGTGGTCT-CAAAACGCACCAGCGATCACTACTTT。1.4.2CRISPR/Cas9 表达载体构建利用引物CrMcPDS-F/CrMcPDS-R 扩 增“gRNA1+骨 架+tRNA
19、+gRNA2”序列,PCR 反应体系(50 L):Biorun Pfu PCR Mix 25 L,CrMcPDS-F 1 L,CrMcPDS-R 1 L,模 板(SEQ1)1 L,Nucle-ase-free Water 补足至 50 L。PCR 反应程序为:94 5 min;94 30 s,50 45 s,72 54 s,循环 30 次;72 10 min,16 30 min。扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。目的片段经切胶、回收后,酶切连接至载体 PHsbdcas9i,获得 pHSb-dcas9i-McPDS-gRNA 表达载体。酶切连接体系:10Buffer 2 L,Bsa1 L,T4
20、_ligase 1 L,PHsb-dcas9i 4 L,胶回收产物 4 L,Nuclease-free Water补足至 20 L。反应条件:37 20 min;37 10 min,20 10 min,循环 5 次;37 20 min,80 5 min。上述使用的模板 SEQ1 序列为:gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgca。取
21、510 L 连接产物转入大肠杆菌 DH5 感受态,将转化菌液涂布于卡那霉素抗性平皿中,37 培养 12 h,挑斑,利用引物 zmpl-chen-F/zmpl-chen-R进行菌斑 PCR,目的片段长度约 800 bp。PCR 反应体系(25 L):Biorun Magic PCR Mix 12.5 L,M13F(100 mol L-1)1 L,zmpl(100 mol L-1)1 L,模 板 1 L,Nuclease-free Water 补 足 至25 L。PCR 反应程序为:94 5 min;94 30 s,50 45 s,72 54 s,循环 30 次;72 10 min,16 30 m
22、in。筛选到阳性克隆后,利用引物zmpl-chen-F 进行测序,对测序正确的菌液提取质粒。引物序列为:zmpl-chen-F:gtaaaacgacggccagt;zmpl-chen-R:ccagaaattgaacgccgaag。2结果与分析2.1苦瓜叶片总RNA提取利用植物总 RNA 提取试剂盒提取苦瓜叶片总RNA,经 1%琼脂糖凝胶电泳获得 2 条清晰条带(图1),RNA 质量浓度为 366.534 ngL-1,A260/A280和A260/A230比值分别为 2.18 和 2.27。结果表明,RNA纯度较高,完整性好,可用于后续试验。2.2苦瓜McPDS基因克隆将上述提取的总 RNA 反
23、转录合成 cDNA,以cDNA 为模板,利用引物 McPDS-F/McPDS-R 进行PCR 扩增,扩增条带约 1700 bp,与预期结果一致,凝胶电泳结果如图 2-A 所示。对 PCR 产物进行凝胶回收,加 A 尾,连接至克隆载体 pMD19-T,转化大肠杆菌 DH5 感受态,涂布于含 100 mgL-1氨苄青霉素的 LB 固体培养基中,37 培养箱中倒置培养 16 h。挑取单菌落,37、200 rmin-1摇菌,PCR检测筛选阳性单克隆(图 2-B),并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果表明,该基因编码区长度 1731 bp,编码 576 个氨基酸。在 NCBI 数据库 B
24、LAST 比对结果表明,该基因编码的氨基酸与甜瓜 PDS 基因编码的氨基酸(NP_001284459.1)同源性高达 93.58%,将该基因命名为 McPDS。2.3生物信息学分析2.3.1苦瓜 McPDS 蛋白理化性质分析利用 Prot-param 在线软件分析苦瓜 McPDS 蛋白理化性质,结果 表 明,苦 瓜McPDS蛋 白 分 子 式 为C2908H4568N772O829S26,相对分子质量为 64.44 kDa,其带正、负电荷残基数均为 69,理论等电点(PI)为 7.09,表明苦瓜 McPDS 为中性蛋白。不稳定指数为44.05(40),属不稳定蛋白。McPDS 脂溶指数为92.
25、08。利用 ProtScale 对苦瓜 McPDS 进行蛋白亲/疏水性分析,总平均亲水性值为-0.154。一般而言,蛋注:14 代表不同的叶片 RNA 样本。Note:1-4 represent different RNA sample of leaves.图 1苦瓜叶片总 RNA 电泳图Fig.1Electrophoretic map of total RNA from bittergourd leaves123428S RNA18S RNA22第3期,等:基因编辑载体构建试验研究白中氨基酸分值与其亲水性呈负相关。苦瓜 McP-DS 蛋 白 氨 基 酸 序 列 中 第 151 位 的 分 值
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