银杏叶提取物注射液对噪音性听力损失的保护机制研究.pdf
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1、中国药物应用与监测 2024 年2月 第21卷第1期 Chin J Drug Appl&Monit,Feb 2024,Vol.21,No.1 42 银杏叶提取物注射液对噪音性听力损失的保护机制研究 黄世斌,高炜旻,陈 寻,董楠楠嘉兴市第二医院耳鼻咽喉科,嘉兴 314000通信作者:黄世斌,Email:H摘要 目的 研究银杏叶提取物注射液(EGB)调控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路对噪音性听力损失(NIHL)的保护作用及机制。方法 将SD大鼠随机分为对照组(Control组)、NIHL模型组(Model组)、低剂量EGB组(EGB-L组,0.7 mgkg-1
2、)、高剂量EGB组(EGB-H组,1.4 mgkg-1)和高剂量EGB+PI3K激活剂740Y-P组(EGB-H+740Y-P组,1.4 mgkg-1 EGB+0.02 mgkg-1 740Y-P)。听觉脑干反应(ABR)评估各组大鼠的听力;HE染色观察大鼠耳蜗组织病理学与螺旋神经节细胞数量;RT-qPCR法测定大鼠耳蜗组织PI3K、MAPK mRNA表达;免疫印迹试验(Western Blot)法检测大鼠耳蜗组织PI3K/MAPK信号通路相关蛋白表达。CCK-8法测定耳蜗毛细胞增殖活性。结果 与Control组相比,Model组大鼠在2、4、8 kHz处左、右耳的听力阈值、耳蜗组织PI3K、
3、MAPK mRNA表达、耳蜗组织PI3K、MAPK、AKT磷酸化水平显著升高(P 0.05),耳蜗组织螺旋神经节细胞和毛细胞数量显著减少(P 0.05);与Model组相比,EGB-H组大鼠相关指标变化与上述相反(P 0.05)。PI3K激活剂740Y-P减弱EGB对大鼠NIHL保护作用。结论 EGB可能通过下调PI3K/MAPK信号通路保护大鼠NIHL。关键词 噪音性听力损失;银杏叶提取物注射液;磷脂酰肌醇3激酶/丝裂原活化蛋白激酶信号通路基金项目 嘉兴市科学技术局公益性研究计划项目(2021AD30124)DOI 10.3969/j.issn.1672-8157.2024.01.011Re
4、search on the protective effect and mechanism of EGB injection on NIHL rats by regulating PI3K/MAPK pathwayHuang Shi-bin,Gao Wei-min,Chen Xun,Dong Nan-nanDepartment of Otolaryngology,Jiaxing Second Hospital,Jiaxing 314000,ChinaCorrespongding author:Huang Shi-bin,Email:HAbstract Objective To research
5、 the protective effect and mechanism of extract of ginkgo biloba(EGB)injection on noise induced hearing loss(NIHL)rats by regulating phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)/mitogen activated protein kinase(MAPK)signaling pathway.Methods Sprague dawley(SD)rats were randomly divided into control group,NIH
6、L model group,low-dose EGB group(EGB-L group,0.7 mgkg-1),high-dose EGB group(EGB-H group,1.4 mgkg-1),and high-dose EGB+740Y-P group(EGB-H+740Y-P group,1.4 mgkg-1 EGB+0.02 mgkg-1 740Y-P).Auditory brainstem response(ABR)was used to evaluate the hearing of rats in each group.Hematoxylin eosin(HE)staini
7、ng was used to observe the histopathological changes of rat cochlea tissue and the number of spiral ganglion cells.The mRNA expression of PI3K and MAPK in rat cochlea tissue was detected by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR).Western blot method was used to detect t
8、he related protein expression on PI3K/MAPK signaling pathway in rat cochlea tissue.The proliferative activity of cochlear hair cells was determined by cell counting kit-8(CCK-8)method.Results Compared with the control group,the hearing threshold of each ear at 2,4 and 8 kHz,the mRNA expression of PI
9、3K and MAPK in cochlea tissue,the phosphorylation level of MAPK,PI3K and protein kinase B(AKT)in cochlea tissue in the model group significantly increased(P 0.05),and the number of spiral ganglion cells and hair cells in cochlea tissue significantly decreased(P 0.05).Compared with the model group,th
10、e changes of the same indicators in the EGB-H group were contrary to those above(P 0.05).740Y-P,a PI3K activator,reduced the protective effect of EGB on NIHL rats.Conclusion EGB might protect NIHL rats by down-regulating PI3K/MAPK signaling pathway.Key Words Noise induced hearing loss;Injection of e
11、xtract of ginkgo biloba;Phosphatidylinositol 3-kinase/mitogen activated protein kinase signaling pathway 噪音性听力损失(noise induced hearing loss,NIHL)是后天性听力损失的主要原因之一,是指暴露在损害性的噪声环境中所引起的一种进行性感音神经性耳聋,以内耳毛细胞损伤为主要病理机制1-2。各国NIHL患病率为11.2%58%3。银杏叶提取物主要成分为银杏内酯和黄酮苷,具有降低血液黏稠中国药物应用与监测 2024 年2月 第21卷第1期 Chin J Drug Ap
12、pl&Monit,Feb 2024,Vol.21,No.1 43 度、抑制血管痉挛以及调节神经递质释放等作用4。银杏叶提取物注射液(extract of ginkgo biloba leaves injection,EGB)在临床常被用于治疗突发性耳聋,但EGB用于治疗NIHL的相关研究未见报道5。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路在SOD2减轻线粒体DNA4843缺陷大鼠噪声和卡那霉素引起的听力损失中发挥重要调节作用6-7。本研究通过
13、建立大鼠NIHL模型,探讨EGB与PI3K/MAPK信号通路在NIHL中的保护作用及其机制。1 材料与方法1.1 实验材料 SPF级SD大鼠60只,雄性,8 12周龄安领生物医药(深圳)有限公司,许可证号:SYXK(粤)2021-0268。饲养环境12 h光明/黑暗循环,温度22 24,相对湿度50%70%。本实验经我院动物伦理委员会批准。大鼠耳蜗毛细胞(美国House研究所)。银杏叶提取物注射液(悦康药业集团有限公司);Zoletil(舒泰,法国维克公司);甲苯噻嗪(昌恒医药生物科技有限公司);PI3K激活剂740Y-P(北京百奥莱博科技有限公司);6860 SW听觉诱发电位系统(美国Sma
14、rtEP公司);Gel Doc EZ自动凝胶成像分析系统(美国伯乐公司)。1.2 方法1.2.1 大鼠NIHL模型的建立、分组与给药 参考文献 8 构建大鼠 NIHL 模型。大鼠给予腹腔注射Zoletil(20 mgkg-1)和甲苯噻嗪(5 mgkg-1),必要时可再次腹腔注射Zoletil(10 mgkg-1)和甲苯噻嗪(2.5 mgkg-1)对大鼠进行麻醉。将麻醉后大鼠置于隔音箱中,给予白噪音(1 20 kHz),强度为121分贝(dB),共处理2 h。其噪声谱和施用剂量根据预实验结果并参考相关文献9确定。本次实验共成功造模48只大鼠,将其随机分为NIHL模型组(Model组)、低剂量EG
15、B组(EGB-L组,0.7 mgkg-1 EGB)、高剂量EGB组(EGB-H组,1.4 mgkg-1 EGB10)和高剂量EGB+PI3K激活剂740Y-P组(EGB-H+740Y-P组,1.4 mgkg-1 EGB+0.02 mgkg-1 740Y-P11),每组12只。造模结束当天开始,EGB-L组、EGB-H组和EGB-H+740Y-P组每日一次腹腔注射相应剂量EGB和740Y-P,持续14 d。Model组每日腹腔注射等量生理盐水。另取12只大鼠作为对照组(Control组),仅麻醉且不噪音干预,之后每日腹腔注射等量生理盐水。1.2.2 听觉脑干反应(auditory brainst
16、em responses,ABR)评估大鼠听力 参考文献8将耳机插入大鼠外耳道,一个皮下针电极放置其前额作为参考电极,另一个皮下针电极作为记录电极放置在乳突上,一个皮下针电极放置在额头下方作为接地电极。电极连接到听觉诱发电位系统上。ABR声音参数设置如下:上升/下降周期为0.5 ms,刺激持续时间为1 ms并且以19.30 s-1的速率扫描1 024次。ABR在2、4、8 kHz处出现音调突发。通过将声压级从80 dB降低到0,每次降低10 dB,这时ABR响应消失,在每个频率下获得ABR。通过减去干预后的听力阈值和干预前的听力阈值获得阈值偏移。在噪音刺激前、刺激后即刻与末次给药后进行ABR测
17、定。1.2.3 HE染色观察大鼠耳蜗病理学变化 末次给药后进行ABR测试,之后脱颈处死全部大鼠。每组随机摘取6只大鼠耳蜗于4 下在10%乙二胺四乙酸中脱钙4周,脱水,石蜡包埋,之后平行于耳蜗轴进行切片(4 m),HE染色。在光学显微镜下观察标本并计数螺旋神经节细胞。使用Image J软件圈出螺旋神经节细胞外部,计算螺旋神经节细胞数量。另取6只大鼠耳蜗组织冻存于80 冰箱中。1.2.4 RT-qPCR法测定大鼠耳蜗组织PI3K、MAPK mRNA表达 取“1.2.3”摘取的耳蜗组织,加入Trizol液提取耳蜗组织总mRNA。用反转录试剂盒反转录为cDNA,再进行PCR扩增。PCR反应体系(20
18、L)为:94 预变性5 min,94 30 s,60 退火30 s,72 延伸30 s,共40个循环。引物如下:PI3K上游引物:5-GGGCGAGGAGTAGCTAGCAG-3,下游引物:CCCAGGTTCCTTCGATCCAG-3;MAPK上游引物:5-TAGGGGTCAGTGTCATCGTTC-3,下游引物:5-CGGTTTGATTCTGCCATAGTGC-3;GAPDH上游引物:5-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3,下游引物:5-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3。使用2-CT计算PI3K、MAPK mRNA的相对表达量。1.2.5 Western Blot检测
19、大鼠耳蜗组织PI3K/MAPK信号通路相关蛋白 取“1.2.3”中摘取的耳蜗组织,加入 RIPA 蛋白裂解液提取总蛋白。BCA 蛋白试剂盒测定蛋白浓度,凝胶电泳,转膜并封闭。用一抗PI3K(11 000)、p38 MAPK(11 000)、p-p38 MAPK(11 000)、GAPDH(11 000)于4 下孵育过夜。次日,加入相应二抗(15 000)室温孵育2 h,加入ECL试剂进行显影,利用Image Lab软件对目标蛋白的灰度值进行计算分析。1.2.6 CCK-8法测定耳蜗毛细胞增殖活性 将耳蜗毛细胞以密度4103个/孔接种于96孔板中,并随机分为正常组、听力损伤组(3 mmolL-1
20、庆大霉素12)、EGB-L组(200 mgL-1)、EGB-H组(400 mgL-113)和EGB-H+740Y-P组(400 mgL-1 EGB+10 molL-1 中国药物应用与监测 2024 年2月 第21卷第1期 Chin J Drug Appl&Monit,Feb 2024,Vol.21,No.1 44 740Y-P14)。置于含5%CO2的37 细胞培养箱常规培养48 h后,每孔中加入10 L CCK-8试剂,37 孵育2 h,使用酶标仪检测各组细胞在450 nm下的吸光度值(OD450)。1.3 数据统计与分析 采用Graph Pad Prism7.0进行统计分析。计量数据采用(
21、xs)表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。P 0.05,差异具有统计学意义。2 结果2.1 各组大鼠听觉阈值比较 在2、4、8 kHz处,在噪音刺激后即刻,与Control组相比,Model组大鼠左、右耳的听力阈值显著升高(P 0.05)。在2、4、8 kHz处,在末次给药后,与Control组相比,Model组大鼠左、右耳的听力阈值显著升高(P 0.05);与Model组相比,EGB-H组大鼠左、右耳的听力阈值显著降低(P 0.05);与EGB-L组相比,EGB-H组大鼠左、右耳听力阈值显著降低(P 0.05);与EGB-H组相比,EGB-H+740Y-P组
22、大鼠左、右耳听力阈值显著升高,差异有统计学意义(P 0.05)。见表1、表2和表3。2.2 各组大鼠螺旋神经节细胞的影响以及 PI3K、MAPK mRNA表达比较 与Control组相比,Model组大鼠耳蜗组织螺旋神经节细胞显著减少(P 0.05);与Model组相比,EGB-H组大鼠耳蜗组织螺旋神经节细胞显著增加(P 0.05);与EGB-L组相比,EGB-H组大鼠耳蜗组织螺旋神经节细胞显著增加(P 0.05);与EGB-H组相比,EGB-H+740Y-P组大鼠耳蜗组织螺旋神经节细胞显著减少(P 0.05)。见表4。与Control组相比,Model组大鼠耳蜗组织PI3K、MAPK mRN
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