一株PEDV广东流行株S1基因遗传进化分析及其在昆虫细胞中的表达纯化.pdf
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1、肇庆学院学报第45卷肇庆学院学报JOURNAL OF ZHAOQING UNIVERSITY第45卷 第2期2024年3月Vo1.45,No.2Mar.2024收稿编号:2023.03.27.0004基金项目:肇庆市科技项目(2021C001);肇庆学院科研项目(QN202225);肇庆学院大学生创新创业项目(X202310580122)作者简介:刘郁夫(1990-),男,广西贺州人,肇庆学院生命科学学院讲师,博士.一株PEDV广东流行株S1基因遗传进化分析及其在昆虫细胞中的表达纯化刘郁夫1,林晓慧1,谭银娟2,冯美莹1(1.肇庆学院 生命科学学院,广东 肇庆 526061;2.华农(肇庆)生
2、物产业技术研究院有限公司,广东 肇庆 526238)摘 要:为了解猪流行性腹泻病毒广东流行株的S1基因流行变异情况,制备相应的诊断试剂,试验采用RT-PCR从猪流行性腹泻疑似发病仔猪的肠道内容物中扩增获得S1基因,利用生物信息学软件构建S1基因的遗传进化树.将S1基因克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac1,转化至DH10Bac感受态细胞中,经抗生素筛选重组杆粒,把重组杆粒转染到昆虫细胞Sf9,盲传3代后进行间接免疫荧光试验和Western blot鉴定.结果表明:该猪流行性腹泻病毒广东流行株分布于GII-b分支,与国内猪流行性腹泻病毒分离株(HN-HB1-2018、HB-HA2015)的核苷
3、酸相似性为98.0%98.3%,而与猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777、DR13的核苷酸相似性仅为89.9%90.0%.且S1重组蛋白可在昆虫细胞Sf9中以细胞培养分泌上清的形式表达.本研究可为猪流行性腹泻病毒的流行现状研究提供参考,以及后续猪流行性腹泻病毒诊断制品的研发提供前期基础.关键词:猪流行性腹泻病毒;S1基因;遗传进化;昆虫细胞中图分类号:S855.3文献标志码:A文章编号:1009-8445(2024)02-0016-06猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是单股正链RNA病毒,属于冠状病毒科冠状病毒属成员,基因组大小约28
4、kb,是引起猪病毒性腹泻的重要病原1.PEDV几乎可感染所有年龄段猪,以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水为主要临床症状,7日龄以内的新生仔猪感染发病死亡率可高达100%,给养猪业造成严重经济损失2.PEDV S蛋白由大约1 383个氨基酸组成,位于病毒囊膜外层,通过弗林蛋白酶酶切位点划分成S1和S2亚基,其中S1亚基含有大多数受体结合位点,是诱导机体产生中和抗体的重要免疫原性蛋白3.PEDV的S1基因具有较高的遗传变异性,是病毒实现免疫逃逸主要方式,临床实践中常通过对PEDVS1基因序列进行测序,监测PEDV流行毒株的变异情况4-6.PEDV阳性病料来源于2020年12月广东省某规模化猪场的发病
5、仔猪病料,经RT-PCR鉴定为PEDV阳性,TGEV、PDCoV和PRoV为阴性.本研究通过RT-PCR扩增出该流行毒株的S1基因片段,对S1基因进行测序分析,并将S1基因ORF全长克隆至pFastBac1质粒中,构建表达PEDVS1蛋白的重组杆状病毒,最后在昆虫细胞Sf9中实现S1重组蛋白的表达纯化.本研究可为PEDV的防控和流行现状研究提供参考,并为后续研制PEDV诊断制品提供基础.1材料1.1 样品PEDV阳性病料来源于2020年12月广东省某规模化猪场的发病仔猪病料,经RT-PCR鉴定为PEDV阳刘郁夫等:一株PEDV广东流行株S1基因遗传进化分析及其在昆虫细胞中的表达纯化第2期性,T
6、GEV、PDCoV和PRoV为阴性,由农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室鉴定保存.1.2 主要试剂pFastBac1质粒和Sf9昆虫细胞由岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心保存;Trizol试剂购自赛默飞世尔科技(15596018);EasyQuick RT MasterMix 购自康为世纪(CW2019),Ex Taq PCR 酶(RR001B)、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(R050A)、BamHI和HindIII限制性内切酶和T载体试剂盒(3271-C1)均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;质粒小量提取试剂盒(D6943)、胶回收试剂盒(D2500)、
7、BAC/PAC DNA小量提取试剂盒(D2156)购自OMEGA公司;SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)、硝酸纤维素膜(FFN02)、BeyoECL Plus(P0018S)购自上海碧云天生物技术有限公司;DH5感受态细胞(C1100)、DH10BAC感受态细胞(C1480)、青链霉素混合液(P1400)、Anti-His鼠源单抗(K200060M)、FITC标记的羊抗鼠二抗(SF131)、羊抗鼠酶标二抗(SE131)购自北京索莱宝科技有限公司;胎牛血清(31985088)、Sf-900 III昆虫细胞培养基(12658035)、脂质体转染试剂Cellfectin II(10362
8、100)、Opti-MEM减血清培养基(31985088)购自Gibco公司.2方法2.1 引物设计与合成根据NCBI网站上公布的PEDV基因序列,设计PEDVS1基因的扩增引物S1-F/R.S1-F:5-ccggaattcatgaagtctttaacctacttctggttg-3,S1-R:5-ccgggatccagaatggtagaagaaaccaggcaac-3,预测扩增片段大小为2 214 bp,引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成.2.2 RNA提取和RT-PCR扩增将肠道内容物加入PBS制备悬浮液,离心取上清按照Trizol试剂(Thermo fisher,15596018)提取总
9、RNA,经反转录试剂(康为世纪,CW2019)反转录后合成cDNA,置于-20冰箱保存备用.以cDNA为模板,S1-F/R引物对为上下游引物进行PCR扩增.PCR反应体系为:5PrimeSTAR GXL Buffer 10 L,dNTP Mixture 4L,PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 L,ddH2O 33 L,cDNA 1 L,上下游引物各1 L.PCR反应程序为:98 预变性3 min;98 变性10 s,60 退火15 s,68 延伸2 min,循环34次;68 终延伸5 min.2.3 S1基因的序列分析将PCR扩增的S1基因片段切胶回收,连接进T载体
10、,转化至大肠杆菌感受态细胞DH5,将PCR检测阳性的单菌落送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序,利用DNAStar软件对测序结果进行拼接整理.从NCBI 网站上下载PEDV 参考毒株的S1基因序列,利用DNAstar 软件进行序列比对,利用Mega6软件,通过Neighbor-Joining法构建遗传进化树,bootstrap值重复1 000次,进行遗传进化分析.2.4 S1重组杆粒的制备首先以引物的形式将S1基因的信号肽序列替换成蜂毒素信号肽序列(MKFLVNVALVFM VVYISYIYA),并在S1基因的5 端设计kozac序列(GCCACC),在S1基因的3 端设计6His标签,并以柔
11、性linker(G4S)3与目的基因相连.将设计改造好的S1基因片段克隆至杆状病毒供体质粒pFastBac1中,测序验证没有移码和突变,命名为pFastBac1-S1.构建重组杆状病毒质粒Bacmid-S1,将构建好的杆状病毒供体质粒pFastBac-S1转化进DH10Bac感受态细胞中,并在含卡那霉素50 g/mL、四环素10 g/mL、庆大霉素7 g/mL、IPTG 125 g/mL、X-gal 100 g/mL的琼脂平板中进行蓝白斑筛选,通过PCR对显白色的单菌落进行鉴定.根据BAC/PAC DNA小量提取试剂盒17肇庆学院学报第45卷(D2156)说明书抽提重组S1蛋白的杆状病毒杆粒B
12、acmid-S1,检测核酸浓度后置于-20 冰箱保存备用.2.5 重组杆状病毒的拯救将Sf9昆虫细胞培养至对数生长期,并以1106个细胞密度接种于6孔细胞培养板,于27 温箱中静置12 h,取3 g的杆粒Bacmid-S1与Cellfectin II 转染试剂(10362100)混合,之后缓慢滴加到Sf9细胞中.于27 温箱中培养96 h,之后连续盲传3代,直至出现Sf9细胞变大、漂浮、脱落等明显细胞病变.2.6 S1重组蛋白的表达与鉴定为鉴定在Sf9细胞中是否表达外源蛋白S1,将收获的杆状病毒病毒液接种至Sf9细胞,置于27 温箱培养72 h后,经4%多聚甲醛固定处理,0.1%Triton
13、X-100细胞透化,分别以anti-His鼠源单抗(1:500稀释)为一抗孵育1 h,用PBS洗涤3次,再用FITC标记的羊抗鼠二抗(1:500稀释)孵育1 h,PBS洗涤3次后置于荧光显微镜下观察.为鉴定表达的重组蛋白分子量大小是否与预期相符,收集已接毒的Sf9细胞培养上清样品和Sf9全细胞蛋白样品进行12%SDS-PAGE电泳,以1:3000倍稀释的anti-His单抗为一抗,HPR标记羊抗鼠二抗的稀释倍数为1:10 000,用Azure Biosystems C600多功能分子成像系统成像.最后通过His标签亲和层析的方式从Sf9细胞上清中纯化S1重组蛋白.3结果与分析3.1 S1基因的
14、克隆及测序利用RT-PCR方法扩增S1基因序列,琼脂糖凝胶电泳结果显示(图1),目的片段大小约2 100 bp,与预期相符.将S1基因扩增片段和pMD19-T载体连接后,转化至大肠杆菌感受态细胞DH5,在抗性平板中挑取单菌落进行摇菌和PCR鉴定,挑取的8个单菌落PCR鉴定均为阳性.随机挑选1、2、3号单菌落的菌液送苏州金唯智生物科技有限公司测序,结果显示3株单菌落的克隆基因序列均一致.且将测序拼接结果与NCBI 网站中公布的PEDV 流行株S1基因进行blast比对,S1基因的开放阅读框中没有移码和提前终止情况出现,因此将 1 号重组质粒命名为pMD19-S1.3.2 基于S1基因的遗传变异分
15、析将测序结果拼接获得S1基因全长序列,序列分析结果显示,GD2020株的S1基因序列长2 214bp,共编码738个氨基酸.GD2020株的S1基因序列与国内PEDV分离株(HB-HA2015)的相似性较高,核苷酸相似性为98.3%,氨基酸相似性为97.7%,但与PEDV经典毒株CV777、DR13相比变异较大,核苷酸相似性为 89.9%90.0%,氨基酸相似性为88.1%88.4%(图 2).提示 PEDV 通过长期流行进化,流行毒株较早期毒株已经发生了较大变化.M.核酸分子质量标准;1.S1基因;2.阴性对照;3-10.菌液PCR鉴定图1 S1基因PCR扩增及菌液PCR鉴定结果图2 GS2
16、020株S1基因序列与参考毒株氨基酸序列比对结果18刘郁夫等:一株PEDV广东流行株S1基因遗传进化分析及其在昆虫细胞中的表达纯化第2期参考NCBI网站上公布的37株PEDVS1基因序列,利用Mega6软件构建遗传进化树.结果显示(图3),这些PEDV毒株可划分成GI和GII两个亚群,GD2020株与其他PEDV近期分离株被划分为GII亚群,与以CV777、DR13等经典株为代表的GI亚群形成了明显的分支差异,再进行细分发现GD2020株与AJ1102、GD-A 等毒株同属于 GII-b 分支.以上结果表明,GD2020株与近年来PEDV国内分离株的亲缘关系较近,属于同一分支,但与早期分离株亲
17、缘关系较远.3.3 S1重组蛋白在昆虫细胞中的表达纯化为表达PEDV GD2020株的S1蛋白,将含S1基因重组杆粒转染Sf9细胞,在Sf9细胞中盲传3代后,可观察到细胞出现细胞肿胀、脱落、死亡等细胞病变(图4),表明重组病毒拯救成功.接着分别通过间接免疫荧光试验和western blots试验检测目的蛋白是否表达.结果显示,S1基因重组杆状病毒感染Sf9细胞72 h后,利用His标签单抗为一抗,可在Sf9细胞内观察到特异性结合的绿色荧光(图5),收集感染后72 h的Sf9细胞培养上清和细胞总蛋白,经 SDS-PAGE 电泳、NC 膜转印、一抗二抗孵育和ECL显色成像后,可在Sf9细胞总蛋白中
18、检测到与His标签抗体发生特异性反应的目的条带,条带大小约78.1 ku,与预期相符(图6),表明成功实现在昆虫细胞中表达S1蛋白,且S1重组蛋白可通过细胞分泌上清的形式进行表达.经His镍株亲和纯化,成功纯化S1重组蛋白,浓度为0.273 mg/mL,纯度90%以上.4讨论与结论上个世纪70年代PEDV被首次报道,随后蔓延至欧洲及亚洲13个国家,现在在世界范围内呈广泛流行.2011年前后PEDV流行毒株出现了明显变异,经典疫苗株CV777不能提供有效保护力,导致以新生仔猪高发病率和高死亡率为特征的PEDV疫情迅速波及全国,并传播至东南亚和北美,给国内外养猪业带来严重经济损失2,7.刘云波等人
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