扬子鳄源粘质沙雷氏菌XCYZE株的分离鉴定及其致病性分析.pdf
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1、中 国 人 兽 共 患 病 学 报C h i n e s eJ o u r n a l o fZ o o n o s e s ,()D O I:/j i s s n 实验研究扬子鳄源粘质沙雷氏菌X C Y Z E株的分离鉴定及其致病性分析朱鹏,周永康,姜纪,李佳佳,易平四,章松,张雪松,周奎厚,王应超,石涵,陈洪超,卜孝林,王雅婷,徐前明中央财政湿地保护基金(N o k j )通讯作者:徐前明,E m a i l:x u q i a n m i n g c o m;O R C I D:作者单位:安徽农业大学动物科技学院,合肥 ;安徽省扬子鳄管理中心,宣城 摘要:目的查明一例源于安徽省扬子鳄管理
2、中心的幼鳄死因.方法从幼鳄脑部组织坏死灶采集病料,进行细菌分离与鉴定,并对其致病性进行分析.结果菌落在血琼脂平板上生长呈红色的革兰氏阴性菌;生理生化试验显示该菌在葡萄糖、甘露醇、乳糖、柠檬酸盐和硫化氢等中均呈阳性;P C R扩增其 Sr DNA基因,其大小约 b p,经遗传进化树分析,与已报道的粘质沙雷氏菌G R D 株在同一分支;其致病性试验可导致实验鼠在 h内全部死亡,出现严重肺出血、肝脏肿大、脾脏肿大、腹水现象等.结论从扬子鳄脑内分离的病原是粘质沙雷氏菌,具有较强的致病性,且对多种抗菌药具有一定的耐药性.本试验为野生动物或者人类感染粘质沙雷氏菌的诊断和治疗提供参考意见.关键词:扬子鳄;粘
3、质沙雷氏菌;鉴定;致病性;耐药性中图分类号:R 文献标识码:A文章编号:()I s o l a t i o n,i d e n t i f i c a t i o na n dp a t h o g e n i c i t ya n a l y s i so fas t r a i no fS e r r a t i am a r c e s c e n sf r o maC h i n e s ea l l i g a t o rZ HUP e n g,Z HOUY o n g k a n g,J I ANGJ i,L I J i a j i a,Y IP i n g s i,Z HANGS
4、 o n g,Z HANGX u e s o n g,Z HOU K u i h o u,WANGY i n g c h a o,S H IH a n,CHE N H o n g c h a o,B UX i a o l i n,WANGY a t i n g,XU Q i a n m i n g(C o l l e g eo fA n i m a lS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,A n h u iA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,H e f e i ,C h i n a;A n h u iP r
5、 o v i n c eC h i n e s eA l l i g a t o rM a n a g e m e n tC e n t e r,X u a n c h e n g ,C h i n a)A b s t r a c t:T h i ss t u d yw a sa i m e da t i d e n t i f y i n gt h ec a u s eo fd e a t ho f ay o u n gc r o c o d i l e f r o mt h eC h i n e s eA l l i g a t o rM a n a g e m e n tC e n t
6、e r i nA n h u iP r o v i n c e D i s e a s em a t e r i a lw a s c o l l e c t e d f r o mt h en e c r o t i cb r a i n t i s s u e l e s i o n so f t h ey o u n gc r o c o d i l e,t h eb a c t e r i aw e r e i s o l a t e da n d i d e n t i f i e d,a n dp a t h o g e n i c i t yw a sa n a l y z e
7、d T h e c o l o n yg r e wo nb l o o da g a rp l a t e s a s r e d,g r a m n e g a t i v eb a c t e r i a P h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a l t e s t s i n d i c a t e dt h a t t h eb a c t e r i aw e r ep o s i t i v e f o rg l u c o s e,m a n n i t o l,l a c t o s e,c i t r a t ea
8、 n dh y d r o g e ns u l f i d e P C Ra m p l i f i c a t i o no f t h e Sr DNAg e n e,w h i c hi sa p p r o x i m a t e l y b pi ns i z e,a n dg e n e t i ce v o l u t i o n a r yt r e ea n a l y s i sw e r ep e r f o r m e d T h es e q u e n c ew a s i nt h es a m eb r a n c ha st h er e p o r t e
9、 dT R D s t r a i no fS e r r a t i am a r c e s c e n s P a t h o g e n i c i t ya n a l y s i s i n d i c a t e dd e a t ho f a l lm i c ew i t h i n h o u r s,a sw e l l a s s e v e r ep u l m o n a r yh e m o r r h a g e,l i v e r e n l a r g e m e n t,s p l e e ne n l a r g e m e n t,a n da s c
10、 i t e s T h ep a t h o g e ni s o l a t e df r o mt h eb r a i no f t h eC h i n e s ea l l i g a t o rt h a tc a u s e dm e n i n g o e n c e p h a l i t i s i sS e r r a t i am a r c e s c e n s,w h i c hh a ss t r o n gp a t h o g e n i c i t ya n dr e s i s t a n c e t oav a r i e t yo f a n t
11、i b a c t e r i a ld r u g s T h i ss t u d yp r o v i d e sar e f e r e n c e f o r t h ed i a g n o s i sa n dt r e a t m e n to fS e r r a t i am a r c e s c e n si n f e c t i o n i nw i l da n i m a l so rh u m a n s K e y w o r d s:C h i n e s ea l l i g a t o r;S e r r a t i am a r c e s c e
12、n s;i d e n t i f i c a t i o n;p a t h o g e n i c i t y;d r u g r e s i s t a n c eS u p p o r t e db yt h e C e n t r a lF i n a n c e W e t l a n d C o n s e r v a t i o n F u n d(N o k j )C o r r e s p o n d i n ga u t h o r:X uQ i a n m i n g,Em a i l:x u q i a n m i n g c o m粘质沙雷氏菌(S e r r a
13、t i am a r c e s c e n s)属于变形菌门肠杆菌科沙雷氏菌属,是沙雷氏菌属中最常见的一种革兰氏阴性菌,菌体较小、短杆状、周生鞭毛,菌株在 下培养有玫瑰红样色素产生,菌落有粘性、呈中心颗粒状、有恶臭气味.大量的临床调查结果显示,虽然粘质沙雷氏菌表现出相对较低的毒力,但它 会引发中枢 神经系统等 疾病,例如脑 膜炎、尿路感染、肺炎、心内膜炎和其他呼吸道疾病等,尤其是在婴儿和免疫功能低下的患者中.此外,粘质沙雷氏菌也会引起伤口和软组织感染 ,发病率及死亡率高达 .粘质沙雷氏菌具有侵袭性,对许多常用抗菌药具有耐药性,现已成为医院感染的重要条件性致病菌,近年来临床分离率及耐药性都有增
14、加的趋势.该菌除了感染人,还可以感染多种动物如白蚁、山羊、水 貂、牦牛、中华鲎、草金鱼、牙鲆 等.扬子鳄是中国特有的一种鳄类动物,为国家一级保护动物,也是世界上濒危物种之一,主要分布在长江中下游流域.由于生态环境的破坏,扬子鳄种群数量急剧下降,近年来围绕着扬子鳄的生存环境、饲养方法、种群繁殖、人工孵化等方面报道较多,但对扬 子 鳄 的 细 菌 性 疾 病 报 道 还 很 空 缺.顾 永 熙等 报道,上海野生动物园在扬子鳄越冬末期,发现条死亡鳄鱼、条病重鳄鱼,通过对其解剖及分离培养,结果分离出株沙雷氏菌,通过动物实验,证实了该菌具有致病性,推测沙雷氏菌是此次鳄鱼死亡的可能原因.唐名艳 通过对扬子
15、鳄血液学及生化指标检测及卵源细菌的分离鉴定,发现鳄鱼胚胎期便有多种细菌感染.年月下旬,安徽省宣城市扬子鳄繁殖研究中心出现条死亡幼鳄,幼鳄生前临床表现为精神萎靡不振、食欲下降、四肢无力、活动减少、行动缓慢、头部左右倾斜、眼神黯淡无光、腹部稍肿胀.剖检见肝脏显著肿大,伴有严重出血、胆囊肿大、肾脏明显水肿、肺脏有多处脓性结节和坏死灶,坏死灶中央有脓汁和干酪样物,脑组织有炎性渗出物.取脑组织病料分离培养,获得株分离菌,经鉴定为粘质沙雷氏菌,可为临床防治该病提供一定借鉴意义.材料与方法主要用品E x T a q酶、d NT P、蛋白酶K、D NAD L M a r k e r购自T a k a r a公
16、司;B l o o dD NA&T i s s u ek i t购自Q I AG E N公司;标准革兰氏染色液购自上海源叶生物科技有限公司;普通肉汤培养基、L B液体培养基、血琼脂平板由本实验室提供;生理生化反应管、药敏片购自杭州微生物试剂有限公司;S P F昆明鼠购自安徽医科大学实验动物中心,本实验已通过安徽农业大学实验动物伦理审查委员会批准,编号为AHAU B .菌株来源株疑似粘质沙雷氏菌分离菌由安徽省宣城市扬子鳄繁殖研究中心的条死亡幼鳄脑组织病料中分离培养获得.菌株的分离培养及形态观察用接种环从幼鳄的脑内坏死灶中挑取炎性渗出物病料,接种于血琼脂平板,置于 恒温培养箱培养 h,挑取疑似沙雷
17、氏菌的菌落接种于普通肉汤培养基于 继续培养 h,观察菌落特征.挑取单个特征性菌落,按常规革兰氏染色法染色,镜检观察细菌形态.分离菌株的生理生化试验将分离并纯化的典型单个菌落接种于普通琼脂培养基,培养 h;在无菌条件下挑取培养的单菌落接种于各种生化鉴定管中,置于 恒温培养箱中培养,观察反应变化,试验结果参照 伯杰氏细菌鉴定手册 进行比对.分离菌株的 Sr DNA基因序列的测定取纯化后的细菌培养液提取细菌D NA,细菌通用引物上下游序列分别为 F:AGAG T T T GAT C C T G G C T C AG 和 R:C G G T T A C C T T G T T A C GA C T T
18、 ,选择细菌通用引物及D NA模板进行 Sr DNA基因序列P C R扩增,P C R产物经琼脂糖核酸凝胶电泳检测后将P C R产物送至南京擎科生物科技有限公司进行测序.测序结果用B L A S T进行比对,利用ME GA X软件构建系统进化树,进行同源性分析.致病性试验选购周龄的昆明鼠进行动物试验.将分离菌进行小鼠致病性试验,分为实验组和对照组,每组只小鼠.实验组小鼠腹腔注射分离菌菌液m L(浓度:C F U/m L),对照组小鼠腹腔注射m L普通肉汤培养基,将小鼠隔离饲养,每h观察次,记录临床表现.药物敏感性试验按常规法用药敏片对分离菌做药敏试验.选用的药敏片有丁胺卡那、恩诺沙星、青霉素、
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