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水翁叶黄酮的提取及抗氧化活性分析.pdf
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1、黄丽华等:水翁叶黄酮的提取及抗氧化活性分析第2期肇庆学院学报JOURNAL OF ZHAOQING UNIVERSITY第45卷 第2期2024年3月Vo1.45,No.2Mar.2024收稿编号:2023.04.14.0003基金项目:2022年大学生创新创业训练计划项目(X202210580112);2023年肇庆市科技创新指导类项目(2023040302001)作者简介:黄丽华(1972-),女,广东揭阳人,肇庆学院生命科学学院高级实验师.通信作者:陈刚(1974-),男,安徽宿县人,肇庆学院生命科学学院教授,博士.水翁为桃金娘科水翁属植物,又名水榕树、水雍树、水龙树等,主要分布于广东省
2、及海南、广西、福建等省区1.水翁为常绿乔木,喜生于河道两岸水边和山谷溪旁;树皮灰褐色,颇厚,叶片薄革质,花期56月,浆果阔卵圆形,成熟时紫黑色2.水翁作为一种常见中药,具有多种临床疗效,其花、叶、根、树皮均可做药用.已有研究表明,水翁花含有多糖、黄酮类、挥发油、酚类等多种成分,具有抗炎、保肝、降血糖及解热镇痛等多种药理活性3;中华草本记载水翁叶含有与水翁花相同的成分,具有清热消滞、解毒杀虫、燥湿止痒之功效4.水翁为广东省地产药材,作为一种特色中药,水翁有多种临床疗效.目前对于水翁花的有效成分的提取及药用作用的研究报道较多,而对于水翁叶的有效活性成分的提取分离及药用作用研究尚未见报道.研究通过对
3、水翁叶的有效活性成分黄酮进行优化提取,同时测定水翁叶黄酮提取液的抗氧化活性等水翁叶黄酮的深入研究,可为其进一步在医药方面的开发利用提供理论依据.1材料与方法1.1 材料、试剂与仪器材料:水翁叶(采摘于肇庆学院行知湖边).试剂:芦丁(北京索莱宝科技有限公司)、无水乙醇(天津市北联精细化学品开发有限公司)、氢氧化钠(广东广试试剂科技有限公司)、亚硝酸钠(天津市北联精细化学品开发有限公司)、硝酸铝(西陇科学股份有限公司)、对氨基苯磺酸(广州化学试剂厂)、铁氰化钾(天津市广成化学试剂有限公司)、抗坏血酸(广州化学试剂厂)、甲醇(广州化学试剂厂)、三氯化铁(天津市科密欧化学试剂有限公司)、硫酸亚铁(广州
4、化学试剂厂)、水杨酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)等均为分析纯,试剂含量均为99%以上.仪器:干燥箱(DHG-9240A,珠江牌),可见分光光度计(722N型,上海仪电),电子天平(BCE3231-1CCN,赛多利斯北京),真空泵(ZKJ-1型,上海)等.水翁叶黄酮的提取及抗氧化活性分析黄丽华,梁敏钰,侯婷华,陈维洁,陈芊霖,陈晓莹,凌海燕,张小凤,陈刚(肇庆学院 生命科学学院,广东 肇庆 526061)摘 要:试验采用正交试验法提取水翁叶黄酮,并测定分析水翁叶黄酮的抗氧化活性.结果表明:水翁叶黄酮提取的最佳工艺为:乙醇浓度40%,料液比1:45 g/mL,浸提时间40 min,得出水翁叶黄
5、酮的提取率为5.24%.抗氧化活性检测表明:在一定质量浓度范围内,随着水翁叶黄酮提取液浓度增加,抗氧化能力逐渐增强,总还原能力及对DPPH自由基的清除力与维生素C(缩写Vc)相当.对亚硝酸根离子和羟自由基的清除率相比Vc稍微弱些.关键词:水翁叶;黄酮;提取工艺;抗氧化活性中图分类号:Q946.91文献标志码:A文章编号:1009-8445(2024)02-0009-07肇庆学院学报第45卷1.2 实验方法1.2.1 工艺流程水翁叶烘干至恒重研磨成粉末过80目筛乙醇溶液浸取超声提取真空减压抽滤测黄酮含量计算得率抗氧化活性测定及分析51.2.2标准品配制方法精确称取10 mg芦丁标准品,用70%乙
6、醇溶液溶解并定容到50 mL,得0.2 mg/mL的芦丁标准液母液;准确吸取0、2、4、6、8、10 mL芦丁母液到相应的25 mL容量瓶中,再分别加入0.7 mL 5%NaNO2溶液,室温静置6 min;再加入0.7 mL 5%Al(NO3)3溶液,摇匀后静置6 min;最后添加5 mL1mol/L NaOH溶液并用70%乙醇定容至25 mL,摇匀后静置15 min,在510 nm处测量其吸光值,以吸光值为纵坐标,芦丁浓度为横坐标绘制芦丁标准曲线6.1.2.3 总黄酮含量的测定按照试验方法提取水翁叶黄酮,再减压抽滤得到黄酮提取液,吸取1mL黄酮提取液,采用上述NaNO2-Al(NO3)3-N
7、aOH显色法测定6,根据吸光值及稀释倍数计算黄酮含量.总黄酮得率=(C*V)/M100%.式中:C为提取液中黄酮含量,mg/mL;V为黄酮提取液体积,mL;M为水翁叶粉末质量,g.1.2.4 单因素试验及正交试验考察不同乙醇浓度、料液比和提取时间对水翁叶黄酮提取率的影响,在单因素试验的基础上采用L9(34)正交试验法优化总黄酮提取工艺7.1.3 抗氧化活性检测1.3.1 总还原能力的测定取不同质量浓度0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.50 mgmL的水翁叶总黄酮提取液2.5 mL,加pH 6.6的磷酸缓冲液2.5 mL及1铁氰化钾1 mL,50水浴20 min,加10
8、三氯乙酸2.5 mL,3 000 rmin离心10 min.取上清液2.5 mL,加2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 0.1三氯化铁,在波长700 nm处测定其吸光度值,同时以Vc做阳性比较(下同)8.1.3.2 DPPH 清除率的测定取不同质量浓度0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.50 mgmL的总黄酮提取液各1 mL于刻度试管中,加入0.04 mg/mLDPPH甲醇溶液5 mL,25条件下避光静置60 min,于517 nm处测定吸光度Ax,以1 mL 50%乙醇为空白测定吸光度A0,未加DPPH的样品溶液测定吸光度Ax09-10.DPPH 清除率/%=A0-(A
9、X-AXO)A0100%.1.3.3 NO2-清除率的测定各取2 mL 5 g/mL NaNO2溶液,再分别加入2 mL质量浓度为0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.50 mgmL的总黄酮提取液于容量瓶中,常温下静置30 min,再加入4 mg/ml的对氨基苯磺酸溶液2 mL混匀,静置5 min;各加入2 mg/mL盐酸萘乙二胺溶液1 mL,用蒸馏水定容至25 mL,常温下静置15 min,于波长538 nm处测其吸光度Ax;按照相同方法,测定不加入样品溶液时NaNO2的吸光度,记为A0;测定不加入NaNO2溶液时样品溶液的吸光度,记为Axo11.NO2-清除率=A0-
10、(AX-AXO)A0100%.10黄丽华等:水翁叶黄酮的提取及抗氧化活性分析第2期1.3.4 OH清除率的测定采用分光光度法及参照Fenton反应体系12:各取2 mL不同浓度0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.50 mgmL的总黄酮提取液于具塞试管中,分别加入6 mmol/LFeSO4、6 mmol/LH2O2、6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液各2 mL,放入37恒温水浴锅水浴35 min,于波长为510 nm处测其吸光度AX,同时测定2 mL蒸馏水代替提取液测得吸光度,记为A0,测定不加入H2O2的提取液吸光度,记为AX0.OH清除率=A0-(AX-AXO)A010
11、0%2结果与分析2.1 标准曲线以芦丁标准品测得黄酮类化合物总黄酮含量的标准曲线为:Y=9.15X+0.0017,R2=0.9991,在080 ug/mL浓度范围内线性关系良好,结果见图1.根据相同方法测定水翁叶黄酮提取液在510 nm处的吸收值,根据标准曲线及稀释倍数,可计算出水翁叶提取液中总黄酮含量.2.2 单因素试验2.2.1 乙醇浓度从图2可见,水翁叶片总黄酮得率在乙醇浓度为40%50%之间逐渐增大,当乙醇浓度为50%,黄酮得率最高达4.59%,当乙醇浓度大于50%时,总黄酮得率逐渐下降.分析其原因为乙醇体积分数越高,醇溶性杂质、色素及亲脂性强的组分浸出量会增加,导致黄酮类化合物提取率
12、下降13.因此,选择乙醇浓度为50%.图1 芦丁标准曲线图2 乙醇浓度对黄酮得率的影响2.2.2 料液比由图3可知,随着溶剂用量的增加,水翁叶黄酮得率呈现先提升后降低的趋势.当料液比为1:40 g/mL时,黄酮得率达3.76%,之后料液比再增加时,总黄酮得率下降.料液比小,提取液中水翁叶黄酮过饱和,提取量反而下降,可能原因是溶剂用量较少时,样品与浸提液的接触面小,随着用量增加,接触面积增加,加快了目标化合物向萃取溶剂的传质速度,从而提高总黄酮得率;随着料液比的增大,水翁叶中的其他物质也逐渐溶解出来,使提取液极性改变从而促使黄酮溶解度下降14.因此,选择料液比为1:40.2.2.3 提取时间如图
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