鲁米诺电化学发光关键中间体的质谱在线表征.pdf

第45卷第1期2024年1月质谱学报Journal of Chinese Mass Spectrometry SocietyVol.45No.1Jan.2024鲁米诺电化学发光关键中间体的质谱在线表征于凯，乔志媛，张铭旺，朱乾龙，刘吉林，王雪凝，余千云1，姜延晓1，张（1.哈尔滨工业大学（威海）海洋科学与技术学院，山东威海2 6 42 0 9；2.哈尔滨工业大学化学化工学院，黑龙江哈尔滨150 0 0 1）摘要：鲁米诺优异的电化学发光性能使其在分析检测领域获得了广泛应用，然而，与反应机理相关的直接数据鲜有报道。本研究基于电化学-微米管-质谱（electrochemistry-micro tube-mass spectrometry，EC-MT-MS)技术，选用具有微米尖端的高硼硅玻璃管作为电解池和质谱电喷雾离子源，通过内置2 根铂金丝电极连接自制的电化学工作站，实现鲁米诺电化学发光反应的实时在线质谱分析，结合串联质谱技术确认了相关产物的分子结构。本工作发现了鲁米诺电化学反应的2 种关键中间体以及发光产物3-氨基邻苯二甲酸，确认了过氧化氢对于鲁米诺发光反应的增益机制。此外，将1,4-苯醒加人鲁米诺-过氧化氢体系，验证了超氧根阴离子自由基（O2，源于过氧化氢）在鲁米诺电发光反应过程中的核心作用，本实验结果为研究鲁米诺发光机理提供了直接的数据参考。关键词：电化学-微米管-质谱（EC-MT-MS)；鲁米诺；过氧化氢；电化学发光；3-氨基邻苯二甲酸中图分类号：0 6 57.6 3doi:10.7538/zpxb.2023.0041On-line Mass Spectrometric Characterizationof Key Intermediates in Luminol ElectrochemiluminescenceYU Kai,QIAO Zhi-yuan,ZHANG Ming-wang,ZHU Qian-long,LIU Ji-lin,WANG Xue-ning,YU Qian-yun,JIANG Yan-xiao,ZHANG Hong,JIANG Jiel(1.Marine Science and Technology,Harbin Institute of Technology(Weihai),Weihai 264209,China;2.School of Chemistry and Chemical Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150001,China)Abstract:Due to the low oxidation potential and high electrochemiluminescence(ECL)quantum yield,Luminol has been widely applied in analytical and detection fields,espe-cially in immunoassay,food safety and environmental monitoring.However,there is alack of sufficient experimental evidence on the ECL mechanism of Luminol,whichaffects the further improvement of its ECL efficiency.Herein,an electrochemistry-micro tube-mass spectrometry(EC-MT-MS)device was constructed for on-line monito-ring of Luminol ECL reaction.In this EC-MT-MS device,a high borosilicate glass tubewith a nano tip was used as electrochemical cell and electrospray ionization source,aplatinum working electrode and a platinum counter electrode were inserted into the tube长洪，姜杰1文献标志码：A文章编号：10 0 4-2 9 9 7(2 0 2 4)0 1-0 141-0 8国家自然科学基金（2 2 0 7 40 2 6）本文通信作者姜杰142and connected to a customized power station,which could simultaneously input a lowvoltage(volt level)for the ECL reaction and a high voltage(kilovolt level)for theformation of electrospray.Prior to the EC-MT-MS experiment,the composition of thereaction solution was optimized to obtain the highest MS signal response,and Luminolwas dissolved in acetonitrile-water(4:1,V/V)solvent with ammonium acetate as theelectrolyte.The concentrations of Luminol and ammonium acetate in the prepared solu-tion were both o.1 mmol/L,and the pH was adjusted to 1l using ammonium aqueous.The oxidation potential of Luminol was subsequently studied using a traditional three-electrode system by cyclic voltammetry in the same solution,and the determined oxida-tion potential for ECL reaction was O.87 V.During the EC-MT-MS measurements,(2.5 kV+0.87 V)and 2.5 kV were input to the working and counter through the pow-er station,respectively.A series of short-lived intermediates and products such as Li(m/z 198)and the luminescent precursor AP-(m/180)in the Luminol ECL reactionprocess were successfully captured and analyzed by MS.The molecular structures ofthese products were characterized by tandem mass spectrometry(MS)technique.There are mainly two fragments of m/z 163,136 present in the MS spectrum of lumi-nescent precursor AP-,attributed to the(NH,+H)and COO losses,respectively.Inaddition,the promotion mechanism of hydrogen peroxide(H,O2)for the ECL perform-ance of Luminol was also investigated.A key reaction intermediate LO,H-was found inthe MS spectrum at m/z 208.Meanwhile,the peak intensity of luminescent precursorAP-significantly increased from 1.3%to 15.7%,proving that the presence of H,O2effectively promoted the generation of key luminescent intermediate.Finally,by adding1,4-benzoquinone to the Luminol-H,O2 system,the central role of the superoxide anionradical（O z-）d e r i v e d f r o m H 2 O 2 i n t h e L u m i n o l ECL p r o c e s s w a s c o n f i r m e d.T h erelevant results provide a direct data reference for the study of the Luminol ECL mechanism.Key words:electrochemistry-micro tube-mass spectrometry(EC-MT-MS);Luminol;hydrogen peroxide;electrochemiluminescence;3-aminophthalic acid鲁米诺因较低的氧化电位和较高的电化学发光(electrochemiluminescence，EC L)量子产率而被广泛应用于免疫分析-2 、食品安全3-41和电化学发光显微镜5 等领域，然而，对于鲁米诺电化学发光反应机理的研究则鲜有报道。Haapakka等6 采用循环伏安法搭配旋转环-圆盘电极，探究了碱性环境下鲁米诺-过氧化氢(H,O,)体系可能的反应机理,示于图1。鲁米诺(L)在电极表面失去电子生成阴离子自由基（L-）,然后L-会被H,O2产生的超氧根自由基Oz（其形成步骤示于式(13)2.7)氧化，此过程有1分子H,O参与，生成中间体LO,H-和1个氢氧根离子OH-8,之后发生N=N一结构的脱离，形成激发态的3-氨基邻苯二甲酸根离子（AP-*），A P-*随后跃迁回基态产质谱学报第45卷生光辐射。H,O,H+HO2HO2HO,+eHO2H+O2安镜如等9使用自制的电化学发光仪，结合键能计算，推导出碱性条件下鲁米诺的发光反应机制,其中,L-与氢氧根离子(OH)反应生成中间产物L1，继续发生脱水反应生成高能态的AP-*。然而，上述工作对于关键中间体的存在并未给出直接的实验证据，导致相关反应机理存在争论，影响后续高效鲁米诺电发光体系的设计与开发。质谱的高灵敏度、快速响应、可解析结构等优点，使其成为理想的电化学反应表征手段10 。电化学-质谱技术的核心是电化学反应(1)(2)(3)第1期于凯等：鲁米诺电化学发光关键中间体的质谱在线表征VNHNH一e143NH2NH2NHOHNH2O-H0鲁米诺(L)NH2OOH+O2.N碱性条件+OH-N加人H202+H20+30H碱性条件-N2-3eFig.1Mechanism of electrochemiluminescence of Luminol装置，需要在满足精确控制电化学反应的同时，实现反应产物的离子化1。Liu等12 采用电化学-中性再电离-质谱法对三联吡啶钉-三丙胺(Ru(bpy);2+-TPrA)等多种电化学发光反应过程进行实时监测，成功捕捉到关键中间体三丙胺中性自由基（TPrA）、二丁基乙醇胺中性自由基(DBAE)等,从而更加准确地推导了上述物质的发光反应路径。Zhang等131使用毛细管微反应器作为电解池，将光电倍增管与文丘里简易声波喷雾电离法相结合，验证了鲁米诺在碱性条件下的电化学反应步骤，然而，该装置未能发现中间体L的存在，也没有完成对关键发光产物AP-的检测。本研究将基于电化学-微米管-质谱（elec-trochemistry-micro tube-mass spectrometry,EC-MT-MS)技术,选用具有微米尖端的高硼硅玻璃管作为电解池和电喷雾离子源，通过内置2根铂金丝电极连接自制的电化学工作站，实现鲁米诺电化学发光反应的实时在线质谱监测，采用串联质谱技术分析相关产物的结构信息；通过捕捉关键中间产物 APLI、L O,H-等,分析共反应物H,Oz对鲁米诺电化学发光的增益机制。LL-H-m/z176NH2O.OHLO2H-AP-*m/z208NH2-OHOH-H20OH0m/z 198图1鲁米诺电化学发光反应机理图1实验部分1.1仪器与装置LTQ-XL质谱仪：美国 Thermo Fisher Sci-entific公司产品，配有Xcalibur数据处理系统；CHI660E电化学工作站：上海辰华仪器有限公司产品；P-1000玻璃管拉制仪：美国SutterInstrument公司产品；电化学工作站：实验室自制，可承受千伏级的高压，并实现恒定反应电位的输出（电路连接图可参考文献14)。1.2样品与试剂鲁米诺（色谱纯）、乙腈（HPLC纯）：美国Sigma-Aldrich公司产品；醋酸铵（分析纯）：上海阿拉丁试剂有限公司产品；乙酸（分析纯）：上海安耐吉试剂有限公司产品；氨水（分析纯）：烟台铁塔试剂有限公司产品；30%过氧化氢（分析纯)：烟台双双化工有限公司产品；去离子水：由Milli-Q超纯水仪制得，为减少水中溶解氧对反应体系的干扰，实验用去离子水均进行N2鼓泡脱氧处理。1.3质谱条件负离子检测模式，质量扫描范围m/z501000；毛细管温度2 7 5，毛细管电压一35V；NH20ECLOH0AP-m/z180NH2O0ECLOH0AP-*+hvNH2+hvOH0AP-m/z180144最大离子注人时间10 ms（全扫描），管状透镜(tube lens)电压一110 V；使用串联质谱分析时，碰撞诱导解离电压为2 535eV。1.4电化学-微米管-质谱法本实验室搭建的电化学-微米管-质谱装置示于图2，其主体为1根具有微米尖端的高硼硅玻璃管，内径1.56 mm，外径2.0 0 mm,通过P-1000拉制仪从玻璃管中间位置熔融拉断，获得约5m尖端。制备的微米管参数如下：温度50 4，牵引力5，速度42，延迟1，压力50 0。此外，对所用微米管进行流速测试，在注入6 0 L反应溶液后，可以持续获得约32.55min的稳定离子流图，计算得出该微米管形成的电喷雾流速为1.8 4L/min。该微米管兼备电化学反应池和电喷雾离子源，电化学反应控制部分由内置于玻璃管的两电极与实验室自制的电化学工作站连接组成，其中工作电极和辅助电极分别为直径0.3、0.4mm的铂金丝，为避免两电极在管内接触导致电化学工作站短路，需在工作电极外套0.5mm玻璃点样管，其两端与铂金丝熔合以隔断反应液浸入。工作E电极辅助电极图2 电化学-微米管-质谱装置示意图Fig.2 Schematic diagram of electrochemistry-microtube-mass spectrometry platform实验时，向玻璃管内注入6 0 L反应液并置人2 根电极，随后将玻璃管固定在三维调节架上，确保进样尖端正对质谱入口约5mm。两电极与电化学工作站连接，同时将质谱高压接到辅助电极上，工作电极和辅助电极的输入电压分别为（2.5kV+E)和2.5kV,其中E为样品发生电化学反应所需的电压。通过该方式能够将电化学反应产生的物质实时送人质谱仪进行分析，实现瞬时态中间体的有效监测。2结果与讨论2.1溶剂组成优化为获得鲁米诺最佳的质谱响应信号，首先质谱学报第45卷对溶剂组成进行筛选。鲁米诺在碱性水溶液中具有更好的溶解性以及发光表现15-16 ，并且Haapakka等6 发现，相比于其他碱性环境，在pH11条件下,鲁米诺展现了更优异的发光性能。因此,本实验利用氨水创造pH 11的碱性溶液环境,同时选择 0.1 mmol/L醋酸铵作为电解质，以减少碱金属氢氧化物（如氢氧化钠、氢氧化钾）对质谱仪的损害。当仅使用去离子水作为溶剂配制0.1mmol/L鲁米诺溶液时，获得的质谱图较为杂乱，难以观察到鲁米诺位于m176的信号峰，示于图3a。随后，向水溶液中添加乙睛并测试两者比例对鲁米诺质谱响应信号的影响。乙腈-水的体积比为1：1时的质谱图示于图3b，虽然可以清楚地发现鲁米诺峰，但其周围仍存在若干杂峰，由于电化学反应产物峰的相对强度较低，需要进一步添加乙以减弱杂峰的干扰。当乙-水的体积比提高到4：1时，m/176峰周边的杂峰几乎消失，能够实现微量反应产物在谱图中呈现，示于图3c。因此，选择乙腈-水（4：1,V/V)溶剂进行后续的电化学-质谱实验。为了实现鲁米诺最佳的电化学反应效率，在质谱入口质谱表征前，使用标准三电极体系和CHI660E电化学工作站分析鲁米诺的循环伏安曲线，以明确氧化电位。选用10 mL的小烧杯作为电2.5kV解池，内置直径3mm铂金棒工作电极，多次弯曲旋绕的铂金丝辅助电极，饱和银/氯化银参比电极。使用乙腈-水（4：1,V/V)溶剂溶解鲁米诺和醋酸铵，配制成含有0.1 mmol/L鲁米诺和0.1 mmol/L醋酸铵的反应溶液，随后用氨水将该溶液调至pH 11。在0 1.0 V扫描区间、100 mV/s扫描速度下，鲁米诺的3圈循环伏安曲线示于图3d，在0.6 5V处观察到明显的氧化峰。因此，在随后的电化学-质谱实验中,采用自制电化学工作站向电极体系输入0.8 7 V（由（0.6 5十0.2 2）V得到，所用参比电极标准电位为0.2 2 V)低电压（E)，以保证鲁米诺进行高效的电化学发光反应。2.2鲁米诺电化学发光反应机理研究选用电化学-微米管-质谱装置在线分析鲁米诺电化学发光反应。反应电压E为OV、持续进样6 min后得到的鲁米诺质谱图示于图4a，只在m/z176处检测到鲁米诺单体失去山第1期于凯等：鲁米诺电化学发光关键中间体的质谱在线表征100a806040200120100C806040200120图30.1 mmol/L鲁米诺在不同溶剂体系的质谱图(a,b,c)和循环伏安曲线(d)Fig.3Mass spectra of 0.1 mmol/L Luminol in differentsolvent systems(a,b,c)and its cyclic voltammetry curve(d)145b17610080604020160200m/z176160200m/z注:a.水;b.乙腈-水(1：1,V/V);c.乙腈-水(4：1,V/V)2402401206d420-20.0 0.2Potential/V160ml/z0.65V0.4 0.60.82002401.0a17610080604020170C10080604020100120140160180200220ml/z注：a.E=0 V;b.E=0.8 7 Vc.m/18 0 二级质谱图；d.m/198二级质谱图图40.1mmol/L鲁米诺电化学发光反应质谱图Fig.4 Mass spectra of the electrochemiluminescence reaction of 0.1 mmol/L Luminol100L-HI17610NH280NH60040L-H-20180190m/z136180-COQ180136NHOH163AP-180bAP-180200170NH2163-H10L1198180190m/zd 154100-H,O198180800-0198-C0Q.1546040200100120140160180200220m/z200NHQOHOHOHO1981802101461个质子的L一H-峰，表明所选的离子化电压（2.5kV)难以引发鲁米诺的电化学反应。在输人0.8 7 V反应电压并持续6 min后，质谱图示于图4b。相比于图4a，分别在m/z180、19 8 处出现新的信号峰，推测为发光产物3-氨基邻苯二甲酸（AP-）和1种反应中间体（L i）。随后，采用串联质谱技术对AP-和Li的分子结构进行解析，示于图4c，m/z 18 0 产生的2 个碎片峰分别为m/z163、136，其中m/z163是由AP-失去1个氨基(NH)和1个氢原子(H)得到的,而m/136是由 AP-失去1个羧基(COO)形成的,该结果与文献17 中3-氨基邻苯二甲酸（AP-）标准品的碎裂方式一致。相应的，m/z198的2 个碎片峰位于m/180、154处，分别对应于失去1个水分子(H,O)和1个羧基（COO)，示于图4d。基于上述结果，2种物质的分子结构分别示于图4c、4d,该实验基本验证了图1中鲁米诺在碱性条件下经L1生成AP-*发光的可能性。2.3鲁米诺-过氧化氢体系电化学发光反应机理研究前期研究18-2 0 1发现,H,O,对鲁米诺电化学质谱学报第45卷发光强度具有明显的增益效应，为探究这一作用机理，向0.1 mmol/L鲁米诺溶液中加入1 mmol/LH,Oz作为共反应物，在0.8 7 V恒电位下记录该体系的电化学反应质谱图。添加H,O,和未添加H,O,的鲁米诺电化学-质谱图分别示于图5a和其中的插图，通过对比可以看出,添加H,O后，中间产物AP-（m/z 18 0)的相对峰强度由1.3%增强至15.7%，近10 倍的提升表明H,O极大地促进了鲁米诺向AP-的转化。文献19 1认为,H,O2生成的超氧根阴离子自由基(O2-)选择性地与鲁米诺阴离子自由基(L-)反应,加速了发光体AP-*的大量产生。为了验证此推论，向鲁米诺-H,O体系中加人0.1mmol/L1,4-苯醌，其对Oz具有优秀的淬灭作用2 1。实现发现，AP-峰的相对峰强度由15.7%下降至2%，示于图5b，证明Oz-是大量生成AP-的关键因素。上述结果基本确认了H2O2存在条件下,L-经由Oz-氧化形成发光物AP-的反应路径。为了进一步验证鲁米诺-H,O2体系电化学发光反应机理，对图1中存在的另一中间体LO,H（m/z 2 0 8)进行检测，示于图5c。m/z 2 0 8aL-HI100100F176806040F2015.70170cL-HJ-100上8060F40200F170注：a.1mmol/LH2O2；b.1m m o l/L H 2 0 2+0.1m m o l/L 1,4-苯；c.m/z208质谱图；d.m/z208二级质谱图Fig.5 Mass spectra of the electrochemiluminescence reaction of Luminol-H,OL-H801766040201.30F170175180 185190AP-m/z180175180m/z176180b10080FAP180185NHOOHLO,H-208190200m/z图5鲁米诺-H,0，体系电化学发光反应质谱图L-H-1766040F20F2OF190170d1001020-2180-0-16480604020210100120140160180200220ml/zAP-180175180m/z180LO2H-208164185190第1期于凯等：鲁米诺电化学发光关键中间体的质谱在线表征处的信号峰强度极低，推测是由于LO,H-生4PRAOBOON N,TANGKUARAM T,KRUEFU成后迅速参与下一步反应生成AP-*，导致其V,KRUEFU V,POOKMANEE P,PHAISAN-SUTHICHOL S,KUIMALEE S,LAOROD-在溶液中的含量较少。随后，采用串联质谱技PHAN N,SATIENPERAKUL S.Fabrication of术对m/z208进行结构解析，其二级质谱图示a simple 3D-printed microfluidic device with于图5d,在离子诱导解离电压作用下,LO,H-embedded electrochemiluminescence detection for主要产生m/z180、16 4碎片离子峰，其中m/zrapid determination of sibutramine in dietary180为LO,H-失去1个N得到，继续失去1supplementsJ.Microchimica Acta,2023,190分子O生成m/164。该结果与LO,H-的分(4):145.子结构基本相对应，由此确定该物质（m/5FENG M H,DAUPHIN A L,BOUFFIER L,208)是鲁米诺-H,O2体系电化学发光反应关键ZHANG F F,WANG Z H,SOJIC N.Enhanced中间体,验证了高能态AP-*源于LO,H-这一cathodic electrochemiluminescence of Luminol oniron electrodesJ.Analytical Chemistry,2021,反应路径。93(49):16 425-16431.6HAAPAKKA K E,KANKARE J J.The 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