什么是感受态及其他问题.doc
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1、(word完整版)什么是感受态及其他问题1。什么是感受态?细菌处于0,0。1M CaCl2低渗溶液中,使菌细胞膨胀成球形,处于容易吸收外源DNA的状态,该状态称为感受态.2。 什么是转化?转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。3. 什么是质粒?独立于染色体之外的共价闭合环状DNA.4. 什么是基因重组?从广义上讲,任何造成基因型变化的基因交流过程,都叫做基因重组。而狭义的基因重组仅指涉及DNA分子内断裂复合的基因交流。5。冷冻离心机的使用及注意事项(1) 开机设定:为了减少仪器的损耗,设定的加速度和减速度要低,最好设为3。(2 )温度:开机后可以先2500rpm空转,直到达
2、到设定温度为止。(3) 开盖:尽量缩短开盖时间,因为时间太长,一方面使离心机内温度升高较大,另一方面也会增加离心机内的水汽凝结,加重了离心机的损耗。(4) 上转子:上转子时切忌用力过大,上的过紧,如果很紧的话会造成缓冲环的损耗。(5) 平衡:现在的冷冻离心机都有自动平衡功能,但是还是要平衡的,这样可以延长离心机的寿命.(6) 放离心管:一定要对称放置,尤其是1。5ml的管子离心时,因为这种转子样品孔很多,容易放错。(7) 转速的设定:离心机都有最高转速限制,不通转子的最高转速不一样,转子越小最高转速越高,注意不要超过最高转速.(8) 善后工作:离心完毕后一定要把离心机的转子卸下来,擦干离心机里
3、的水滴,然后在关机。电动机的轴承加注润滑脂;检查整流子和电刷的磨损情况,有磨损过度的应立即更换。6.移液器的使用及注意事项(1)吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指,绝不允许突然松开,以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气.(2)为获得较高的精度,吸头需预先吸取一次样品溶液,然后再正式移液,因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时,吸头内壁会残留一层”液膜”,造成排液量偏小而产生误差。(3)浓度和粘度大的液体,会产生误差,为消除其误差的补偿量,可由试验确定,补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。(4)可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法,来校正取液器,1mL 蒸馏水20时
4、重0。9982g.(5)移液器反复撞击吸头来上紧的方法是非常不可取的,长期操作会使内部零件松散而损坏移液器。(6)移液器未装吸头时,切莫移液。 所设量程在移液器量程范围内不要将按钮旋出量程,否则会卡住机械装置,损坏了移液器。 数字清清楚楚在显示窗中, 旋转到所需量程 (7)在设置量程时,请注意(8)移液器严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体(如浓酸、浓碱、有机物等)。(9)严禁使用移液器吹打混匀液体。(10)不要用大量程的移液器移取小体积的液体,以免影响准确度.同时,如果需要移取量程范围以外较大量的液体,请使用移液管进行操作7。转化率及转化总数的计算统计每个培养皿中的菌落数. 转化后在含抗生素的
5、平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下: 转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积 转化频率(转化子数每mg质粒DNA)转化子总数质粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数对照组菌落数稀释倍数菌液总体积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数8. 简述影响转化效率的因素提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素: (1). 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于的培养菌,最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液.细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD600 来控制
6、。DH5菌株的OD600 为0。5时,细胞密度在5107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适.密度过高或不足均会影响转化效率.(2)。 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA).转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低.1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 (3)。 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR。),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 (4)。 防
7、止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦.9。碱性裂解法提取质粒DNA的基本原理碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12。0-12。5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。 当加入pH4。
8、8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去.10。质粒有几种构型,转化率如何?细菌质粒DNA有可以相互转化的3种不同构型,即线状、环状、超螺旋。微生物常常通过质粒倡导从而在自然条件下发生基因重组,常见的方式有:接合、传导、转化.超螺旋转化率最高。11. 加入溶液,的目的和作用?碱裂解法提取质粒DNA的基本原理是溶液I使细胞悬浮,并且EDTA可以与C
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