酶的生产与分离纯化瑶瑶ppt课件.ppt
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1、酶的生的生产与分离与分离纯化化 1 1.酶的生的生产组织提取提取发酵生酵生产化学及生物合成化学及生物合成2 2.集中集中垄断,市断,市场全球化全球化:丹麦诺和诺得公司(诺维信novozymes)美国杰能科(Genencor)、芬兰科特和丹麦丹尼斯克3 3.品种、品种、品种、品种、规规模不断模不断模不断模不断扩扩大大大大国际以液体、颗粒为主。国内糖化酶、-淀粉酶、蛋白酶三大类重要产品系列果胶酶、低温碱性蛋白酶,国内尚未投入生产;我国7家。应用用领域不断域不断扩大大食品工业占62%4 4.酶的的发酵生酵生产:经过预先先设计,通,通过人工操作控制,利用人工操作控制,利用细胞的生命活胞的生命活动,产生
2、人生人们所需要所需要酶的的过程程5 5.能用于能用于酶发酵生酵生产的的细胞需胞需具具备如下几个如下几个条件条件:(1)产酶量高量高(2)容易培养和管理)容易培养和管理(3)产酶稳定性好定性好(4)利于)利于酶的分离的分离纯化化(5)安全可靠)安全可靠6 6.酶的的发酵技酵技术为什么利用微生物什么利用微生物产酶?(1)种种类多、多、酶种丰富,且菌株易种丰富,且菌株易诱变,菌种多,菌种多样。(2)生生长繁殖快,易提取繁殖快,易提取酶.(3)培养基来源广泛、价格便宜。培养基来源广泛、价格便宜。(4)微微电脑,连续化、自化、自动化,化,经济效益高。效益高。(5)利用以基因工程利用以基因工程为主的主的现
3、代分子生物学技代分子生物学技术,7 7.产酶微生物微生物产酶种种类、产量、量、发酵条件、工酵条件、工艺。主要包括主要包括细菌、放菌、放线菌、酵母菌、霉菌。菌、酵母菌、霉菌。8 8.(1)枯草芽)枯草芽孢杆菌杆菌细菌属菌属菌落粗糙,不透明菌落粗糙,不透明生生产-淀粉淀粉酶、蛋白、蛋白酶、-葡聚糖葡聚糖酶,碱性磷酸,碱性磷酸酶等。等。9 9.(2)大大肠杆菌杆菌阴性,无芽阴性,无芽孢菌落光滑菌落光滑用于谷氨酸脱用于谷氨酸脱羧酶,天,天门冬氨酸冬氨酸酶等等胞内胞内酶1010.(3)黑曲霉)黑曲霉属于真菌属属于真菌属糖化糖化酶、淀粉、淀粉酶、酸、酸性蛋白性蛋白酶、果胶、果胶酶等。等。1111.(4)米
4、曲霉米曲霉糖化糖化酶、蛋白、蛋白酶1212.(5)根霉)根霉主要用于糖化主要用于糖化酶、淀、淀粉粉酶、转化化酶等生等生产1313.(6)毛霉)毛霉蛋白蛋白酶、糖化、糖化酶、淀、淀粉粉酶、脂肪、脂肪酶等。等。1414.(7)链霉菌霉菌葡萄糖异构葡萄糖异构酶、青、青霉素霉素酰化化酶、纤维素素酶、几丁、几丁质酶等等1515.(8)啤酒酵母)啤酒酵母转化化酶丙丙酮酸脱酸脱羧酶1616.产酶菌株的菌株的选育育 主要依据主要依据酶催化的反催化的反应性性质、作用底物的特异作用底物的特异性性、底物和底物和产物的特性物的特性以及以及酶在在细胞中所胞中所处的位的位置置。胞外胞外酶:菌落周:菌落周围的的透明圈、透明
5、圈、颜色色变化来化来筛选。胞内胞内酶:若:若酶作用底物分子量小可透作用底物分子量小可透过细胞膜,胞膜,将将酶反反应的的产物作物作为底物,加在培养基中,根据底物,加在培养基中,根据菌落菌落颜色色变化化。而多数胞内而多数胞内酶产生菌的生菌的筛选:细胞破碎物做胞破碎物做酶源,源,经酶反反应后,根据后,根据酶反反应产物的特点来物的特点来筛选(辅酶NAD)。1717.选择性能性能优良的良的产酶微生物微生物培养基培养基设计选择合适的合适的发酵方式酵方式发酵酵过程的各种参数控制程的各种参数控制酶的的发酵技酵技术重要1818.保藏保藏细胞胞细胞活化胞活化细胞胞扩大培养大培养原生原生质体体固定化固定化细胞胞固定
6、化原生固定化原生质体体预培养培养发酵酵发酵酵分离分离纯化化酶重要1919.主要是碳源、氮源,其次是无机主要是碳源、氮源,其次是无机盐、生、生长因子因子和和产酶促促进剂等。等。重要培养基培养基2020.(1)碳源)碳源当前当前酶制制剂生生产上使用的菌种大都是只能上使用的菌种大都是只能利用利用有机碳有机碳的异养型微生物。的异养型微生物。重要吃点吃点啥?2121.重要有机碳的主要来源有:一是有机碳的主要来源有:一是农副副产品中品中二是野生的原料二是野生的原料以石油以石油产品中品中1216碳的成分碳的成分2222.考考虑营养要求养要求、诱导作用作用、分解代分解代谢物阻遏作用物阻遏作用。淀粉淀粉酶生生产
7、用用淀粉淀粉不用不用果糖果糖重要2323.(2)氮源)氮源有机氮源和无机氮源有机氮源和无机氮源重要一般来一般来说,动物物细胞、植物胞、植物细胞、异胞、异养型微生物、自养型微生物。养型微生物、自养型微生物。有机氮源和无机氮源配合有机氮源和无机氮源配合我有我要求我有我要求2424.只用只用铵盐或硝酸或硝酸盐为氮源氮源时,酶产量量仅为有有胨时的的30%只用有机氮源而不用无机氮源只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低量也低使用高使用高浓度有机氮源外尚需添加度有机氮源外尚需添加1%3%的无机氮的无机氮源。源。重要2525.(3)碳氮比碳氮比一般蛋白酶(包括酸性、中性和碱性蛋白酶)低;淀粉酶(包括淀粉酶、糖
8、化酶、淀粉酶等)高,在糖化酶生产培养基的碳氮比是最高的。2626.(4)无机无机盐常以磷酸二常以磷酸二氢钾、磷酸、磷酸氢二二钾等磷酸等磷酸盐作作为磷源磷源,以硫酸,以硫酸镁为硫源和硫源和镁源源。钙 灰色灰色链霉菌中性蛋白霉菌中性蛋白酶 pH77.5 pH57。重要2727.钠离子离子控制控制细胞渗透胞渗透压酶产量增加,以磷酸量增加,以磷酸氢二二钠及及硝酸硝酸钠等形式,例如米曲霉等形式,例如米曲霉淀粉淀粉酶重要2828.(5)生)生长因子因子 微量的物微量的物质,或生,或生长素。素。某些氨基酸、某些氨基酸、维生素、生素、嘌呤或呤或嘧啶。重要有你才有你才健康!健康!2929.(6)产酶促促进剂 产
9、酶促促进剂一是一是诱导物,二是表面活性物,二是表面活性剂。表面活性表面活性剂能能增加增加细胞的通透性,改善氧的胞的通透性,改善氧的传递速度,保速度,保护酶的活性。的活性。重要3030.发酵方式的酵方式的选择固固态发酵法酵法液体深液体深层发酵法酵法3131.(1)pH对产酶的影响的影响一般来一般来说,培养基成分中碳,培养基成分中碳/氮氮(C/N)比高,比高,发酵液,酵液,pH低;低;C/N低,低,pH高。高。添加添加缓冲液;冲液;调节通通风量量.调节培养基的初培养基的初始始pH;pH过高糖或淀粉来高糖或淀粉来调节,pH过低氮低氮调节。3232.一般一般细菌菌为37,霉菌和放,霉菌和放线菌菌为28
10、30,而生,而生产糖化糖化酶的最适温度的最适温度为3740。(2)温度温度对产酶的影响的影响 微生物代微生物代谢反反应、发酵中通酵中通风、搅拌速度拌速度发酵初期酵初期菌体繁殖旺盛菌体繁殖旺盛时3333.(3)耗氧量和通耗氧量和通风量量对产酶的影响的影响溶解氧而定。目前用于溶解氧而定。目前用于酶制制剂生生产的微生的微生物都物都为好气性微生物,采用自好气性微生物,采用自动测定和定和记录溶解氧的溶解氧的仪表。表。3434.(4)搅拌的影响拌的影响 有利于有利于热交交换、营养物养物质与菌体均匀接触,与菌体均匀接触,提高新提高新陈代代谢。打破空气气泡,使。打破空气气泡,使发酵液形成酵液形成湍流,提高溶氧
11、量,增加空气利用。湍流,提高溶氧量,增加空气利用。3535.(5)泡沫的影响泡沫的影响泡沫阻碍了泡沫阻碍了CO2的排除,影响溶氧量的排除,影响溶氧量机械消泡,消泡机械消泡,消泡剂3636.食品用食品用酶发酵生酵生产实例例1、-淀粉淀粉酶的生的生产生生产菌种:菌种:细菌和曲霉,如枯草芽菌和曲霉,如枯草芽孢杆菌、杆菌、黑曲霉等。黑曲霉等。发酵方法:霉菌,固体曲法;酵方法:霉菌,固体曲法;细菌,液体菌,液体深深层发酵。酵。回收方法:回收方法:盐析、有机溶析、有机溶剂沉淀和淀粉吸沉淀和淀粉吸附等。附等。3737.2、果胶、果胶酶的生的生产生生产菌种:真菌如曲霉菌、青霉菌,菌种:真菌如曲霉菌、青霉菌,细
12、菌菌如枯草芽如枯草芽孢杆菌、欧氏杆菌。杆菌、欧氏杆菌。发酵:固体曲法和液体深酵:固体曲法和液体深层发酵酵回收:水提后加入乙醇沉淀。回收:水提后加入乙醇沉淀。3838.酶的分离纯化3939.酶的的纯化化 特定的一种酶在细胞中的含量很少 酶可以通过测定活力加以跟踪4040.酶分离分离纯化的一般原化的一般原则1、可靠和快速的、可靠和快速的测活方法;活方法;2、酶原料的原料的选择;3、酶的提取;的提取;4、酶的提的提纯;5、酶的的纯度度检验。4141.酶提提取取分分离离纯化化技技术路路线发酵培养酵培养动物器官物器官植物植物组织微生物微生物提取提取胞内胞内酶胞外胞外酶细胞破碎胞破碎研磨研磨酶分离分离纯化
13、化离心分离,离心分离,过滤分离,沉淀分分离,沉淀分离,离,层析分离,析分离,电泳分离,萃泳分离,萃取分离,取分离,结晶分离等。晶分离等。酶浓缩酶贮存存4242.机械破碎机械破碎捣碎法碎法研磨法研磨法匀匀浆法法 物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法 化学破碎化学破碎有机溶有机溶剂:甲苯、丙甲苯、丙酮丁醇、丁醇、氯仿仿表面活性表面活性剂:Triton、Tween酶促破碎促破碎自溶法自溶法外加外加酶制制剂法法通通过机械运机械运动产生的剪切生的剪切力,使力,使组织、细胞破碎。胞破碎。使使组织、细胞的外胞的外层结构破构破坏坏对细胞膜的作用胞膜的作用通通过
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