低氧下LDLR与PDGFR-β在牦牛肾细胞中的表达_陈伟基.pdf

722023年 第53卷 第2期牦牛是青藏高原特有的原生物种，长期高原低氧环境生活使其在生理功能和基因层面均产生了各种适应机制，是研究高原动物适应低氧环境的最佳试验对象，在动物低氧环境适应研究方面具有重要价值1。研究表明，低氧环境和疾病引起的肾脏局部缺氧可导致肾功能严重受损，引起慢性肾炎、慢性间质性肾炎、肾病综合征、无症状性蛋白尿等疾病2-4，这些疾病在发生过程中均存在着不同程度的因缺氧而产生的细胞病变5。血小板衍生生长因子（PDGF）是间充质细胞的有丝分裂原和化学引诱剂，在发育、组收稿日期：2022-12-06基金项目：中央高校重点项目（31920190083）；大学生创新训练项目（X202210742291）；大学生创新创业训练计划项目（X2022107420302）。作者简介：陈伟基，硕士，讲师，主要从事高原动物适应性研究。E-mail：织修复、动脉粥样硬化和肿瘤形成等过程中发挥着重要作用1。PDGF是肾脏疾病中最具特征的生长因子之一。激活的PDGF信号主要诱导系膜细胞增殖、细胞外基质合成以及肾间质纤维化。PDGFR是PDGF的受体，在肾纤维化过程中，PDGFR被磷酸化，然后通过SH2结构域与磷酸肌醇3-激酶（PI3K）的p85亚基结合，从而激活AKT通路中的下游分子。增强的PDGFR信号被认为与人类和试验动物的肾小球疾病发病机制有关。多项研究为PDGF功能在肾脏疾病发病机制中的分子机制提供了新的见解。如敲除PDGFR-基因后会特异性抑制相应基因产物的表达；低氧下LDLR与PDGFR-在牦牛肾细胞中的表达陈伟基，李美语，张庭慧，姚一凡（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030）摘要：为探究牦牛肾脏高原低氧适应性特点，比较低氧培养下牦牛肾细胞内LDLR基因和PDGFR-基因与常氧培养下的表达差异，本试验以牦牛肾细胞作为研究对象，分别进行常氧（21%）和低氧（1%）处理，通过实时荧光定量PCR法检测细胞内LDLR基因和PDGFR-基因的mRNA表达变化。结果显示：在低氧培养下，PDGFR-和LDLR基因与常氧处理相比表达量显著下调（P0.05），但PDGFR-基因随时间增长而恢复正常水平，LDLR基因则一直处于低表达状态。此现象可能是牦牛肾脏能够适应低氧环境的主要原因之一，可为揭示牦牛低氧环境适应机制提供一定理论依据。关键词：牦牛；肾细胞；低氧；LDLR；PDGFR-中图分类号：S823.8+5文献标识码：A文章编号：1006-799X（2023）02-0072-04试验研究DOI:10.15979/62-1064/s.2023.02.0022023年 第53卷 第2期73试验研究Hanudel6等研究表明PDGFR-对肾大部切除后肾小球系膜细胞的适应性反应具有重要作用。低 密 度 脂 蛋 白 受 体（L o w d e n s i t ylipoproteinreceptor，LDLR）是维持脂质代谢平衡的主要受体，在肾脏中高度表达，并与甾醇调节元件结合蛋白2（sterol-regulatoryelement-bindingprotein-2，SREBP2）和SREBP切割激活蛋白（SREBP-cleavageactivatingprotein，SCAP）形成一个紧密的反馈环，构成调节LDL胆固醇吸收的关键系统。当细胞内胆固醇异常时，LDLR基因的表达在SREBP2的易位介导下改变，并进入细胞核与LDLR启动子内的固醇调节元件（SRE-1）位点结合，通过SCAP激活基因转录，LDLR-SREBP2-SCAP负反馈系统被破坏会加剧肾脏中的脂质积聚7。本 研 究 通 过 观 察 低 氧 对L D L R基 因 和PDGFR-基因在牦牛肾细胞中表达的影响，探究牦牛肾脏低氧适应机制，可为治疗低氧导致的慢性肾病提供治疗思路，为高原医疗提供参考资料。材料与方法1.1试验材料1.1.1参试细胞牦牛肾原代细胞由甘肃省动物细胞技术创新中心提供。1.1.2主要设备三气箱、倒置显微镜、实时荧光定量PCR仪、DMEM/HIGHGLUCOSE培养基。1.1.3主要试剂新生牛血清采购自兰州民海公司，0.25%胰蛋白酶、PBS均采购自北京CellMax公司，反转录试剂盒、qPCR试剂盒采购自湖南艾科瑞公司。1.2试验方法1.2.1牦牛肾细胞培养使用含有10%新生牛血清（NBS）的DMEM培养基。在37、5%CO2普通培养箱中进行常氧培养，在三气箱中以37、5%CO2和1%O2条件下进行低氧培养。待细胞融合率达到约90%时按照14比例进行传代或冻存。1.2.2PDGFR-与LDLR基因表达水平检测分别收取低氧（1%）和常氧（21%）条件下培养24h、48h、72h和96h的细胞，用Trizol法提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书的步骤将其反转录成cDNA后进行实时荧光定量PCR检测，引物序列见表1，每个基因设置3个复孔，反应体系及程序见表2，用2-CT法计算基因相对表达量。1.3统计分析利用GraphPad软件统计并分析基因表达量的差异性，P0.05时差异显著，P0.01时差异十分显著，P0.001时差异极其显著，P0.05时差异不显著。结果与分析实时荧光定量PCR检测结果表明，牦牛肾细胞中的PDGFR-基因在低氧培养前72h内对比常氧组均有显著下调（P0.05），第2448h有逐渐降低趋势，并在第48h时降至最低，但7296h过程中随低氧培养时间增长有显著回基因引物序列（53）产物长度（bp）登录号PDGFR-AGGTGGCTGAGGCTGGCTACTA100XM_021085013.1AGCACACGGACAGGCACATTGALDLRAAGGTGTGAAGAGGAAGAC254NM_001166530.1GATGCTGGAGATGGAGTG-actinAGGCTGTGCTGTCCCTGTATG207NM_001101.5GCTCGGCTGTGGTGGTAAA表1RT-qPCR引物信息742023年 第53卷 第2期升，低温培养96h后，PDGFR-基因表达量恢复到常氧水平下的表达量（图1A）。在低氧条件下，LDLR基因表达水平虽也随低氧培养时间增长而逐渐上调（图1B），但与常氧培养相比整体水平下降，2496h均显著低于常氧组，其中第24h表达量最低，第4896h各有小幅度回升。试验研究表2RT-qPCR反应体系及程序反应试剂用量（20L体系）反应程序2xUniversalSYBRGreenFastqPCRMIX10L预变性：953min；变性：95，5s；退火：60，32s（40个循环）；保存：4，cDNA模板0.2LPrimerF0.4LPrimerR0.4LddH2O9L图1基因表达检测结果注：A、B分别为PDGFR-和LDLR基因的mRNA表达水平；*表示P0.05，*表示P0.01，*表示P0.001。综上所述，牦牛肾细胞中PDGFR-和LDLR的mRNA表达量均受到低氧诱导，在低氧培养状态下显著下调，但随低氧培养时间递增而逐渐恢复到正常水平，该现象可能由PDGFR-和LDLR基因在肾脏中逐渐适应低氧环境并与之对抗的过程所引起。讨论在低氧应激情况下，细胞维持稳态对机体具有重要作用，但若机体长期处于缺氧环境中，则LDLR会因无法实现天然折叠，而无法维持表达水平的稳定，故其氧化折叠适应性较差。有研究表明，PDI家族成员ERdj5在异构化过程中可充当LDLR的还原酶。此外，缺氧处理改变了缺氧时LDLR的折叠，HIF和UPR的激活可能会增加限制性折叠因子的丰度从而导致LDLR基因表达下调2，这与本研究结果一致，即牦牛肾细胞中LDLR基因在低氧应激时出现极显著的下调，但随着低氧培养时间增长而逐渐回升。推测此结果的出现可能与低氧导致的HIF快速激活有关。缺氧激活HIF-1及其下游分子，包括脯氨酰羟化酶3和葡萄糖转运蛋白-1，对HIF-1进行基因沉默可消除由缺氧诱导的TGF-1、-SMA基因上调和PDGFR-基因下调。缺氧加剧了周细胞的氧化应激。缺氧诱导的PDGF-BB通过激活AKT、ERK1/2和STAT3信号通路可增强细胞增殖和迁移。在本研究中，PDGFR-在低氧培养初期有显著下调现象，但随着时PDGFR-LDLR2023年 第53卷 第2期75试验研究间增长逐渐恢复至正常水平，是因为细胞在低氧培养条件下产生了大量HIF-1，从而导致PDGFR-的转录被大幅限制，但随着牦牛肾细胞对低氧环境的适应，其转录水平逐渐恢复至常氧水平从而使肾脏功能恢复3。此外，肾脏间充质内PDGFR-阳性细胞中von Hippel-Lindau（Vhl）蛋白的缺失与缺氧信号的遗传诱导导致肾皮质和外髓质中HIF-2依赖性红细胞生成素（EPO）的大量表达有关。所有PDGFR-亚群中的Vhl缺失均可诱导EPO表达。在低氧血症条件下，PDGFR-亚群中肾上腺髓质素和G蛋白信号调节因子4的表达也在不同的缺氧刺激下上调。因此，存在不同的肾细胞PDGFR-亚群，能够响应不同的刺激产生EPO。这些细胞中缺氧信号的激活也可能诱导有助于改善肾间质组织氧合水平4，这可能是牦牛肾脏可以适应缺氧微环境的主要原因之一。结论低氧培养下，牦牛肾细胞中的PDGFR-和LDLR基因与常氧相比显著下调，但PDGFR-随时间增长而恢复正常水平，LDLR则一直处于低表达状态。此现象可能是牦牛肾脏能够适应低氧环境的主要原因之一，但其具体作用机制仍需进一步研究。参考文献1张剑搏,丁学智,Ahmad,等.高原土著动物适应性进化的研究进展J.畜牧兽医学报,2019,50(9):1723-1736.2TImamura,JXue,OPoulsen,etal.Intermittenthypoxiaandhypercapniainducesinhibitorofnuclearfactor-Bkinasesubunit-dependentatherosclerosisinpulmonaryarteriesJ.AmericanJournalofPhysiology.Regulatory,IntegrativeandComparativePhysiology,2019,317(6):763-769.3LZhang,YZhang,JZhou,etal.CombinedtranscriptomeandproteomeanalysisofyakPASMCsunderhypoxicandnormoxicconditionsJ.PeerJJournals,2022,10:e14369.4JHLim,JMYook,SHOh,etal.ParicalcitolImprovesHypoxia-InducedandTGF-1-InducedInjuryinKidneyPericytesJ.InternationalJournalofMolecularSciences,2021,22(18):9751.5 白雪峰,崔燕,余四九,等.低氧诱导因子-1对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化的影响J.畜牧兽医学报,2020,51(3):620-629.6HanudelM,WongS,JungG,etal.Ameliorationofchronickidneydisease-associatedanemiabyvadadustatinmiceisnotdependentonerythroferrone.J.KidneyInternational,2021,100(1):79-89.7LAPalmer,KimberlydeRonde,KBrown-Steinke,etal.Hypoxia-inducedchangesinproteins-nitrosylationinfemalemousebrainstem.J.AmericanJournalofRespiratoryCellandMolecularBiology,2015,52(1):37-45.（编辑：张璐）