microRNA-130a...胞肺表面活性物质合成的影响_黄青兰.pdf

医学理论与实践2023年第36卷第8期Vol.36，No.8，Apr2023J Med Theor PracmicroNA-130a 对肺泡上皮细胞肺表面活性物质合成的影响*基金项目:福州市科技计划项目(2020 WS 102);福州市 2019 年市级临床重点专科建设项目(20191204)。通信作者:严争黄青兰严争刘凡陈晓婷鄢晓宁福建医科大学附属福州市第一医院，福建省福州市350009摘要目的:目的:探讨 microNA-130a 对 A549 肺泡上皮细胞中肺表面活性物质(PS)合成的影响。方法:方法:体外培养 A549肺泡上皮细胞株，应用 microNA-130a 模拟物和抑制剂干预细胞，将细胞分为模拟物组(mimic 组)、模拟物阴性对照组(mimic-NC 组)、抑制剂组(inhibitor 组)、抑制剂阴性对照组(inhibitor-NC 组)和空白对照组(blank 组);采用 CCK-8法检测各组细胞增殖情况;采用 T-PC 法检测 microNA-130a 和 SP-A、SP-B、SP-C、SP-D mNA 表达水平;采用Western blot 法检测 SP-A、SP-B、SP-C、SP-D 蛋白表达水平。结果:结果:mimic 组 microNA-130a 表达水平显著高于 mimic-NC 组和 blank 组(P 0 05);inhibitor 组 microNA-130a 表达水平明显低于 inhibitor-NC 组和 blank 组(P 0 05);同一时点各组细胞增殖活力间差异无统计学意义(P 0 05);mimic 组 SP-A、B、C、D mNA 和蛋白表达水平均显著低于mimic-NC 组和 blank 组(P 0 05);inhibitor 组 SP-A、B、C、D mNA 和蛋白表达水平均明显高于 inhibitor-NC 组和blank 组(P 0 05)。结论:结论:microNA-130a 可抑制 A549 肺泡上皮细胞中 PS 的合成。关键词microNA-130a肺表面活性物质A549 肺泡上皮细胞中图分类号:722.1文献标识码:Adoi:10.19381/j.issn.1001-7585.2023.08.002Effect of microNA-130a on Pulmonary Surfactant Synthesis in Alveolar Epithelial CellsHUANG Qinglan，YAN Zheng，LIU Fan，et al Fuzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University，Fuzhou City，Fujian Province350009ABSTACT Objective:To study the function of microNA-130a on the synthesis of pulmonary surfactant(PS)in A549 alve-olar epithelial cells Methods:A549 alveolar epithelial cell line was cultured in vitro，and microNA-130a mimics and inhibi-tors were applied to treat the cells The cells were divided into mimic group，mimic-NC group，inhibitor group，inhibitor-NCgroup and blank group Cell proliferation was measured using CCK-8 assay The mNA expression levels of microNA-130aand SP-A/B/C/D were determined using T-PC The protein expression levels of SP-A/B/C/D were detected by Westernblot esults:The expression level of microNA-130a in mimic group was remarkably up-regulated than that in mimic-NCgroup and blank group(P 0 05)The expression level of microNA-130a in inhibitor group was significantly lower thanthat in inhibitor NC group and blank group(P 0 05)There was no obviously difference in cell proliferation activity amongall groups at the same time point(P 0 05)The SP-A/B/C/D mNA and protein levels of in mimic group were remarkablydecreased than those in mimic-NC and blank groups(P 0 05)The SP-A/B/C/D mNA and protein levels of in inhibitorgroup were remarkably increased than those in inhibitor NC and blank group(P 0 05)Conclusion:microNA-130a inhib-its pulmonary surfactant synthesis in A549 alveolar epithelial cellsKEY WODSmicroNA-130aPulmonary surfactantA549 Alveolar epithelial cells新生儿呼吸窘迫综合征(Neonatal respiratorydistress syndrome，NDS)是围产期婴幼儿常见危重症之一，有较高的致死率和致残率1，其主要是由于新生儿尤其是早产儿出生时肺发育不成熟，肺表面活性物质(Pulmonary surfactant，PS)缺乏。PS 是由肺泡 2 型上皮细胞分泌的一种成分复杂的脂蛋白，具有降低肺泡表面张力、维持肺泡容量的稳定、预防肺水肿以及调节呼吸道免疫的作用2。胚胎肺发育的成熟和肺泡上皮细胞合成 PS 的过程受很多因子的调节，包括糖皮质激素、催乳素、生长因子、雌激素、雄激素和甲状腺激素3-4。研究显示，microNAs在肺发育和 PS 的代谢调控中也同样发挥关键作用5-6。但关于其调控 PS 合成的研究仍非常有限。本研究选择 microNA-130a 作为一个参与 PS 合成的潜在候选基因，通过分析其在 PS 合成中的作用，旨在为 NDS 发病机制的研究及防治提供依据。1材料和方法1 1主要试剂和材料A549 人肺泡上皮细胞株(北纳创联，北京);胎牛血清 FBS(Ausbian，澳大利亚);DMEM 培养基(Invitrogen，美国);microNA-130a 模拟物、抑制剂以及相应阴性对照(ibobio，广州);Lipo3000 转染试剂(Invitrogen，美国);细胞计5621J Med Theor PracVol.36，No.8，Apr20232023年第36卷第8期医学理论与实践数试剂盒 CCK-8(碧云天，北京);TIzol(宝生物，大连);microNA 逆转录试剂盒(诺唯赞，南京);m-NA 逆转录试剂盒(宝生物，大连);SYB GreenqPC 试剂盒(宝生物，大连);相关引物设计合成(ibobio，广州);蛋白裂解液(碧云天，北京);SP-A、SP-B、SP-C、SP-D 一抗(博奥森，北京);-actin 及辣根过氧化物酶标记二抗(万类生物，沈阳)。12细胞培养及分组用加入 10%FBS 和 100U/ml青链霉素的 DMEM 培养基孵育 A549 人肺泡上皮细胞，培养环境:5%CO2，37。待细胞生长到覆盖培养皿的 75%后，弃去培养液，PBS 清洗两遍，加入新培养基，然后将细胞接种于 6 孔板中，细胞密度为 1 106/ml。培养 24h 待细胞稳定贴壁后，将其分为 micro-NA-130a 模拟物组(mimic 组)、模拟物阴性对照组(mimic-NC 组)、microNA-130a 抑制剂组(inhibitor组)、抑制剂阴性对照组(inhibitor-NC 组)和空白对照组(blank 组)。应用 Lipo3000 转染试剂在各组中分别转染对应的 microNA-130a 模拟物、模拟物阴性对照、抑制剂、抑制剂阴性对照和等体积的培养基。转染 48h 后，收集各组细胞用于后续分析。1 3CCK-8 检测细胞增殖将 A549 细胞以 2 104/ml 的细胞密度接种到 96 孔板，培养24h 待细胞稳定贴壁后，按 1 2 中分组将细胞分为 mimic 组、mimic-NC 组、inhibitor 组、inhibitor-NC 组 和 blank组，继续培养 24h、48h 和 72h。然后加入 CCK-8 检测试剂 10l，在 37下继续孵育 2h，通过酶标仪在450nm 处测量样本吸光度值。1 4T-PC 检测 mNA 相对表达量收集各组细胞，利用 TIzol 提取细胞中总 NA 并检测其浓度和纯度。之后分别应用 microNA 和 mNA 逆转录试剂盒将总 NA 逆转录成 cDNA，通过 SYB 染料法进行 PC 检测，以 U6 和-actin 作为内参，采用2 Ct法分析各组中 microNA-130a、SP-A、SP-B、SP-C、SP-D 基因表达水平，各基因引物序列见表 1。表 1引物序列基因引物序列microNA-130aF5-AAAGGATCCGCATCAAGCCCGAAGTAT-35-AAAGAATTCGAGGCAGTGTCTATCACAAG-3SP-AF5-GATGGGCAGTGGAATGACAGG-35-GGGAATGAAGTGGCTAAGGGT-3SP-BF5-CAAACGGCATCTGTATGCAC-35-CGGAGAGATCCTGTGTGTGA-3SP-CF5-TCATCGTCGTGGTGATGGTG-35-ATGGAGAAGGTGGCAGTGGTAA-3SP-DF5-ATGTTGCTTCTCTGAGG-35-TCAGAACTCGCA-3U6F5-CTCGCTTCGGCAGCACA-35-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3-actinF5-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-35-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-31 5Western blot 检测蛋白表达应用蛋白裂解液提取细胞中的总蛋白，BCA 法测定其浓度后，按每孔 20g 蛋白上样量进行 SDS 凝胶电泳，将分离后的蛋白转移至 PVDF 膜上，以 5%脱脂奶粉室温封闭 1h。分别用 SP-A、SP-B、SP-C、SP-D 和-actin 一抗(稀释比例分别为 1 800、1 800、1 800、1 800 和1 2 500)，4孵育过夜，用 TBST 洗涤 3 遍后加入二抗(稀释比例为 1 5 000)孵育 2h，用化学发光凝胶成像系统对蛋白印迹进行检测，以-actin 作为内参分析各蛋白相对表达水平。1 6统计学方法采用 SPSS22 0 软件对结果进行分析，数据以(x s)表示，多组间比较采用单向方差分析，两两比较采用 SNK-q 检验，检验水准 为0.05。P 0 05 时差异有统计学意义。2结果2 1细胞转染效果鉴定如图 1 所示，转染 48h后，mimic 组 细 胞 中 microNA-130a 表 达 水 平 是mimic-NC 组和 blank 组的 7 倍左右(P 0 001);同时，inhibitor 组细胞中 microNA-130a 表达水平约为inhibitor-NC 组和 blank 组的 30%(P 0 01)。图 1各组细胞中 microNA-130a 表达水平比较与 mimic 组比较，P 0 001;与 inhibitor 组比较，#P 0012 2microNA-130a 模拟物和抑制剂对 A549 细胞增殖的影响随着培养时间的延长，各组细胞增殖吸光度均稳定上升。但同一时点各组细胞增殖吸光度间差别无统计学意义(P 0 05)。见表 2。表 2不同时点各组细胞增殖吸光度比较(x s)组别24h48h72hmimic 组284 0 22323 019376 0 35mimic-NC 组299 0 31331 028391 0 25blank 组291 0 45336 012397 0 13inhibitor-NC 组277 0 36329 011384 0 20inhibitor 组268 0 14316 034368 0 19F 值043703480 721P 值077908400 5972 3过表达和抑制 microNA-130a 对 SP-A、SP-B、SP-C 和 SP-D mNA 表达的影响与 mimic-NC 组和 blank 组相比，过表达 microNA-130a 的 mimic 组可显著下调 A549 细胞中 SP-A、B、C、D mNA 的表达水平，差别有统计学意义(P 0 05)。当使用抑制剂沉默 microNA-130a 时，inhibitor 组 SP-A、B、C、D mNA 表达明显升高，与 inhibitor-NC 组和 blank组比较差别具有统计学意义(P 0 05)。见图 2。2 4过表达和抑制 microNA-130a 对 SP-A、SP-B、SP-C 和 SP-D 蛋白表达的影响Western blot 结果显示，与 mimic-NC 组和 blank 组相比，mimic 组中SP-A、B、C、D 蛋 白 的 表 达 水 平 显 著 降 低(P 0.05)。同时，与 inhibitor-NC 组和 blank 组相比，in-hibitor 组 SP-A、B、C、D 蛋白表达显著上调(P 0.05)，见图 3、图 4。6621医学理论与实践2023年第36卷第8期Vol.36，No.8，Apr2023J Med Theor Prac图 2各组 SP-A、SP-B、SP-C 和 SP-D mNA 相对表达水平比较与 mimic-NC 组比较，*P 0 05，P 001;与 blank 组比较，#P 0 05，#P 001，#P 0001;与 inhibitor-NC 组比较，P 0 01，P 0 001图 3各组 SP-A、SP-B、SP-C 和 SP-D 蛋白表达条带图 4各组 SP-A、SP-B、SP-C 和 SP-D 蛋白相对表达水平比较与 mimic-NC 组比较，*P 0 05;与 blank 组比较，#P 0 05，#P 001;与 inhibitor-NC 组比较，P 005，P 0 013讨论肺发育是一个连续的过程，受到多种因素的影响，肺泡上皮细胞是肺发育过程中重要组成部分，其发育异常可导致与肺发育相关的各种疾病。由于围产科学、新生儿重症监护技术的不断进步，早产儿的存活率显著提高，伴随而来的是与早产儿肺发育密切相关的疾病如 NDS、支气管肺发育不良等发病率逐年上升。NDS 又称新生儿肺透明膜病，指新生儿出生后不久即出现进行性呼吸困难和呼吸衰竭等症状，这是导致围产期新生儿死亡的重要原因7。NDS 发病机制复杂，其中 PS 合成、分泌不足和/或消耗增多是 NDS 的主要致病因素。PS 是一种肺泡细胞上生成的具有表面活性的脂蛋白复合物，包括 SP-A、SP-B、SP-C 和 SP-D 等表面物质活性蛋白，具有增加肺的顺应性、降低肺泡表面张力、防止肺不张、防止肺水肿的作用，在促进新生儿肺发育、维护正常肺功能方面亦发挥重要作用。机体中一旦 PS分泌不足，即可造成呼吸困难、肺水肿等疾病，甚至会有生命危险8。PS 的表达具有组织特异性，主要来源于肺泡型上皮细胞，A549 细胞是人肺腺癌细胞株，来源于肺泡上皮细胞，是研究肺上皮细胞功能的重要替代细胞系。因此我们选择 A549 细胞作为本研究的工具细胞。PS 的合成分泌受多种因素调控，如糖皮质激素、催乳激素、胰岛素、生长因子等。除了以上因素，最近的一些研究发现，microNAs 也参与了新生儿肺发育以及 PS 的合成过程9-12。microNAs 是一类自然产生的短链非编码 NA 分子，长度为 21 25个碱基，microNAs 可与一个或多个 mNA 分子具有部分互补作用，其主要功能是通过多种方式下调靶基因表达，参与转录后水平的调控13-14。在急性呼吸窘迫综合征动物模型中，microNA-214、451 表达明显增加，而 microNA-16、23a、24、181a/b、199a表达显著降低。这表明 microNAs 在呼吸窘迫的发病过程中可能有着重要的调节作用15。microNA-130a 是一种与肿瘤和心脑血管疾病关系密切的小NA 分子16-19，最近的一些研究发现 microNA-130a 在促进肺发育和维护肺功能方面也有重要作用20-22，但尚未见其调控 PS 合成的研究报道。本次实验中，通过细胞转染的方式将 A549 细胞中 mi-croNA-130a 进行过表达和抑制处理，然后测定了细胞增殖活性的变化以及 SP-A、B、C、D 基因转录和蛋白表达水平。既往的研究报道，microNA-130a在细胞增殖、分化过程中也发挥重要作用，micro-NA-130a 可抑制缺氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞以及骨关节炎软骨细胞的增殖和分化23-24。然而，本研究发现过表达或抑制 microNA-130a 均对 A549细胞的增殖活力无显著影响，考虑 microNA-130a在细胞增殖和分化中的作用可能依赖于其靶基因，其可能通过不同的信号通路产生不同的功能。此外，本研究发现过表达 microNA-130a 可显著下调细胞中 SP-A、B、C、D 的基因转录和蛋白表达水平。7621J Med Theor PracVol.36，No.8，Apr20232023年第36卷第8期医学理论与实践抑制剂处理的 A549 细胞中 SP-A、B、C、D 基因转录和蛋白表达水平则明显升高。以上结果提示 mi-croNA-130a 可能是通过调控 SP-A、B、C、D 表达参与了肺泡上皮细胞上 PS 的合成。本研究首次探讨了 microNA-130a 在肺泡上皮细胞 PS 合成中的作用，但研究过程仍存在一定局限性:(1)本研究中仅采用了单一的 A549 细胞株进行的体外研究，结论仍需通过多种细胞株以及相应的体内实验进行验证;(2)microNA-130a 调控 SP-A、SP-B、SP-C 和 SP-D 表达的具体机制仍不清楚，还需通过进一步的实验来阐明。综上所述，microNA-130a 在肺泡上皮细胞中对 PS 合成具有一定的调控作用，为 NDS 发病机制的研究及防治提供了新的研究方向。参考文献 1Hamid EA，Ali WH，Azmy A，et al Oxidative Stress and Anti-Oxidant Markers in Premature Infants with espiratory DistressSyndromeJ Open access Macedonian journal of medical sci-ences，2019，7(17):2858-2863 2You H，Huang X Effect of pulmonary surfactant on the preventionof neonatal respiratory distress syndrome in premature infantsJ American journal of translational research，2021，13(4):3642-3649 3Veldhuizen，Nag K，Orgeig S，et al The role of lipids in pulmo-nary surfactant J Biochimica et biophysica acta，1998，1408(2-3):90-108 4Khawar H，Marwaha K SurfactantM Treasure Island(FL):StatPearls Publishing，2022 5Bhaskaran M，Wang Y，Zhang H，et al MicroNA-127 modulatesfetal lung development J Physiological genomics，2009，37(3):268-278 6Zhang XQ，Zhang P，Yang Y，et al egulation of pulmonary surfac-tant synthesis in fetal rat typealveolar epithelial cells by micro-NA-26a J Pediatric pulmonology，2014，49(9):863-872 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