实验16-酶切与连接.ppt

成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验实验十 限制性酶切与连接 成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验 一种能够结合外源DNA 片段形成重组DNA，并能进行自我复制的DNA 分子称为Vectors.主要载体：质粒、噬菌体、病毒 按功能分类：克隆载体（构建基因组文库或cDNA 文库）、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不同功能的新载体，如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体。载体（Vectors）结构的三大要素：结构的三大要素：多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位由由 pUC18pUC18改造而来，大小为改造而来，大小为 3162bp 3162bp。相当于在相当于在 pUC18pUC18中增加了带有中增加了带有 M13 M13 噬菌体噬菌体 DNA DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。（二）材料 n模板DNA n引物：APO A1-GST2(载体：pGEX-6P-1)PrimerGST6p1-APOA1-Up:5 GGAATTCATGGATGAACCCCCCCAGAGCC-3 EcoRIPrimerGST6p1-APOA1-down:5 CGCGTCGACTCA CTG GGT GTT GAG CTT CT-3 SalI粘性末端粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5在双链上交错切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验一、一、DNADNA的限制性酶切实验原理的限制性酶切实验原理n核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，功能犹似高等功物免疫系统，用于抗击外来侵袭。n限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的片段端为，端为。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验n根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类。n第一类（I型）限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序，在识别位点很远的地方任意切割DNA链，切割核苷酸顺序没有专一性，随机。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。n第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。1.限制性内切酶的类型限制性内切酶的类型成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验n第二类（型）限制性内切酶就是通常指的限制性内切酶.n 它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段；n型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序；n型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出、端突出和平末端。n限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。1.限制性内切酶的类型限制性内切酶的类型成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验限制性内限制性内切酶切酶酶分子酶分子识别位点识别位点切割位点切割位点 限制作用限制作用是否需用是否需用 ATP类类 三三亚亚基基双双功能酶功能酶 二二 分分 非非 对对称称至至 少少 在在 识识别别位位点点外外 1000bpYes类类内内 切切 酶酶 与与甲甲 基基 化化 酶酶分分 子子 不不 在在一起一起4-6bp,大大多多 数数 为为 回回文文 对对 称称 结结构构 在在 识识 别别 位位点点 中中 或或 靠靠近近 识识 别别 位位点点 无无 特特 异异性性No类类二二 亚亚 基基 双双功能酶功能酶 5-7 bp 非非对称对称在在 识识 别别 位位点点下下游游 24-26bpYes成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验n型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出、端突出和平末端。n限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验粘性末端粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5在双链上交错切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：5 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 切割后形成5 GAT ATC 33 CTA TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。平头末端：平头末端：成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验v用用属属名名的的头头一一个个字字母母和和种种名名的的头头两两个个字字母母表表示示寄寄主主菌菌的的物物种种名名称称，如如E.E.colicoli 用用EcoEco表表示示，所所以以用用斜斜体字。体字。v用用 一一 个个 字字 母母 代代 表表 菌菌 株株 或或 型型，如如 流流 感感 嗜嗜 血血 菌菌(HeamophilusHeamophilus influenzaeinfluenzae)Rd)Rd菌株用菌株用d d，即，即HinHind d。v如如果果一一种种特特殊殊的的寄寄主主菌菌株株，具具有有几几个个不不同同的的限限制制与与修修饰饰酶酶，则则以以罗罗马马数数字字表表示示，如如HinHind,d,HinHindd，HinHindd等。等。2.2.限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验内切酶：内切酶：n不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；n注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；n内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定，通常内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定，通常 1u1u指在适当条件下，指在适当条件下，1 1小时内完全酶解小时内完全酶解ugug特定底物特定底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以所需要的限制性内切酶量，使用中一般以ugug DNA DNA对对u u酶短时间为宜。酶短时间为宜。n同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；n 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。对内切酶的污染。注意事项注意事项注意事项注意事项限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验n作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、能含酚、氯仿、乙醚、SDSSDS、EDTAEDTA、高盐浓度、酒精等，这高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。n这种抑制可通过：这种抑制可通过：增加酶作用单位数（增加酶作用单位数（1020U/ug DNA1020U/ug DNA）、）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。或延长反应时间加以克服。五、注意事项五、注意事项五、注意事项五、注意事项限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切：成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验n反应缓冲液主要由反应缓冲液主要由TrisTrisHClHCl、NaClNaCl、Mg2Mg2+组成，其中组成，其中Mg2Mg2+为内切酶辅基；为内切酶辅基；nTrisTrisHClHCl维持反应体系维持反应体系pHpH值在值在7.2-7.67.2-7.6之间；之间；nNaClNaCl浓度不同形成种级别的离子强度：浓度不同形成种级别的离子强度：低盐（低盐（10mM 10mM NaClNaCl)中盐（中盐（50mM 50mM NaClNaCl）高盐（高盐（100mM 100mM NaClNaCl）n 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。五、注意事项五、注意事项五、注意事项五、注意事项限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切反应缓冲液：反应缓冲液：成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验连接反应连接反应连接反应连接反应-连接酶（连接酶（连接酶（连接酶（ligase）ligase又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（ATP)的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等 连接酶的催化反应过程需要Mg离子 成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验 T4 DNA 连接酶催化双链DNA相邻核苷酸的5-磷酸和3-羟基之间的连接，平端和粘端都可被连接。本酶也能催化RNA 连接到 DNA 或者双链RNA 上，但不催化单链核酸的连接。把一个片段克隆到质粒载体时，采用1:1,1:3或 3:1 的载体:插入片段摩尔比 连接反应连接反应连接反应连接反应-T4-T4连接酶连接酶连接酶连接酶反应体系：反应体系：载体载体 DNA 100ng插入片段插入片段DNA 17ng连接酶连接酶 10X 缓冲液缓冲液 1lT4 DNA 连接酶连接酶(Weiss 单位单位)0.11u无核酸酶水加至无核酸酶水加至 10ul2.孵育反应于：室温下孵育反应于：室温下3 小时，或小时，或4C 过夜，或过夜，或15C，418 小时。小时。实验步骤与试剂实验步骤与试剂实验步骤与试剂实验步骤与试剂（酶切）（酶切）（酶切）（酶切）反应体系反应体系1.1.质粒质粒pUC18 DNA 2lpUC18 DNA 2l2.2.PCRPCR产物产物 2l2l3.3.HindHind内切酶内切酶 2l2l4.4.Hind Hind 10 X buffer 2l2l5.ddH2O 12l12l总体系为总体系为20 l20 l，混匀，混匀反应步骤反应步骤1.1.37C 37C 酶切酶切2h2h2.2.65C 65C 灭活灭活10min10min3.3.琼脂糖电泳检测琼脂糖电泳检测1.1.内切酶失活内切酶失活2.2.DNADNA不纯，含有不纯，含有SDSSDS，酚，酚，EDTAEDTA等内切酶抑制因子等内切酶抑制因子3.3.条件不适（试剂、温度）条件不适（试剂、温度）4.4.DNADNA酶切位点上的碱基被酶切位点上的碱基被甲基化甲基化5.5.DNADNA酶切位点上没有甲基酶切位点上没有甲基化（如化（如DpnDpn I I）6.6.DNADNA位点上存在其它修饰位点上存在其它修饰7.7.DNADNA不存在该酶识别顺序不存在该酶识别顺序1.1.标准底物检测酶活性标准底物检测酶活性2.2.将将DNADNA过柱纯化，乙醇沉淀过柱纯化，乙醇沉淀DNADNA3.3.检查反应系统是否最佳检查反应系统是否最佳4.4.换用对换用对DNADNA甲基化不敏感的同裂甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒酶酶解，重新将质粒DNADNA转化至转化至dcmdcm-，dam-dam-基因型的细菌菌株基因型的细菌菌株5.5.换用不同切割非甲基化位点的同裂换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化酶消化DNADNA（如（如San3A ISan3A I代替代替DpnDpn I)I)，重新将质粒转至重新将质粒转至dcmdcm+dam+dam+菌菌株中扩增株中扩增6.6.将将DNADNA底物与底物与DANDAN混匀进行切混匀进行切割验证割验证7.7.换用其它的酶切割换用其它的酶切割DNADNA或过量酶或过量酶消化进行验证消化进行验证限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切常见问题分析常见问题分析常见问题分析常见问题分析q问题一：问题一：DNADNA完全没有被内切酶切割完全没有被内切酶切割 原原因因对对策策1.1.内切酶活性下降内切酶活性下降2.2.内切酶稀释不正确内切酶稀释不正确3.3.DNADNA不纯，反应条件不佳不纯，反应条件不佳4.4.内切酶识别的内切酶识别的DNADNA位点上的碱位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰基被甲基化或存在其它修饰5.5.部分部分DNADNA溶液粘在管壁上溶液粘在管壁上6.6.内切酶溶液粘度大，取样不准内切酶溶液粘度大，取样不准7.7.酶切后酶切后DNADNA粘末端退火粘末端退火8.8.由于反应溶液、温度、强烈振由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性荡使内切酶变性9.9.过度稀释使酶活性降低过度稀释使酶活性降低10.10.反应条件不适反应条件不适11.11.识别位点两侧插入了可影响酶识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序切效率的核酸顺序1.1.用用5-105-10倍量过量消化倍量过量消化2.2.用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3.3.同上同上4.4.同上同上5.5.反应前离心数秒反应前离心数秒6.6.将内切酶稀释，增大取样体积将内切酶稀释，增大取样体积7.7.电泳前将样品置电泳前将样品置6565保温保温5-105-10分分钟，取出后置冰浴骤冷钟，取出后置冰浴骤冷8.8.使用标准反应缓冲液及温度，避使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡免强烈振荡9.9.适当稀释酶液，反应液稀释的酶适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏不能贮藏10.10.使用最佳反应体系使用最佳反应体系11.11.加大酶量加大酶量5-105-10倍倍q问题二：问题二：DNADNA切割不完全切割不完全 原原因因对对策策限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析1.1.内切酶星状活性内切酶星状活性2.2.其它内切酶污染其它内切酶污染3.3.底物中含其它底物中含其它DNADNA杂质杂质1.1.检查反应条件：甘油浓度大于检查反应条件：甘油浓度大于12%12%，盐度过低，盐度过低，Mn2+Mn2+的存在及酶：的存在及酶：DNADNA值过大均均可导致星状活性，值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量降低酶的用量2.2.用用DNADNA作底物检查酶切结果作底物检查酶切结果3.3.电泳检查电泳检查DNADNA，换用其它酶切，换用其它酶切，纯化纯化DNADNA片段片段q问题三：问题三：DNADNA片段数目多于理论值片段数目多于理论值 原原因因对对策策限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析1.1.DNADNA定量错误（如定量错误（如RNARNA含量较高）含量较高）2.2.在酶切反应液中形成非在酶切反应液中形成非特异的沉淀特异的沉淀1.1.用用RNARNA酶酶A A（无（无DNADNA酶）酶）100ug/ml100ug/ml消化消化DNADNA样，酚抽提样，酚抽提后沉淀溶解，定量后沉淀溶解，定量2.2.在反应前透析在反应前透析DNADNA样品或用酒精样品或用酒精沉淀二次沉淀二次q问题四：酶切后没有观察到问题四：酶切后没有观察到DNADNA片段的存在片段的存在 原原因因对对策策限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析1.1.保存温度不合适保存温度不合适2.2.以稀释形式保存以稀释形式保存3.3.贮藏缓冲液不适当贮藏缓冲液不适当4.4.低蛋白浓度低蛋白浓度1.1.内切酶贮藏在含内切酶贮藏在含50%50%甘油的甘油的贮藏液中，应在贮藏液中，应在-20-20低温保低温保存存2.2.稀释酶液不宜长期存放，应一稀释酶液不宜长期存放，应一次使用次使用3.3.使用厂家推荐的贮藏缓冲液使用厂家推荐的贮藏缓冲液4.4.内切酶与内切酶与500ug/ml500ug/ml的的BSABSA一起一起保存保存q问题五：内切酶保存期内快速失活问题五：内切酶保存期内快速失活 原原因因对对策策限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析1.1.DNADNA上结合有蛋白质上结合有蛋白质2.2.内切酶中含有内切酶中含有DNADNA外外切酶切酶1.1.减少酶用量或消化时间，换减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶用新包装的酶2.2.减少酶用量或消化时间，换减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶用新包装的酶q问题六：电泳后问题六：电泳后DNADNA片段的带型弥散，不均一片段的带型弥散，不均一 原原因因对对策策DNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析1.1.含磷酸盐的浓度高含磷酸盐的浓度高2.2.内切酶失活不全或含有内切酶失活不全或含有ATPATP酶酶3.3.平末端连接平末端连接4.4.外切酶污染外切酶污染5.5.连接缓冲液不合适连接缓冲液不合适1.1.透析，乙醇沉淀去除磷酸盐透析，乙醇沉淀去除磷酸盐2.2.延长灭活时间或用酚抽提，乙延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收醇沉淀回收DNADNA3.3.加大加大T4 DNA T4 DNA LigaseLigase用量用量4.4.减少酶用量，缩短保温时间，减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收酚抽提回收DNADNA5.5.重新配制连接缓冲液重新配制连接缓冲液DNADNADNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析q问题七问题七：酶切后的酶切后的DNADNA片段连接效率低片段连接效率低 原原因因对对策策1.1.DNADNA降解降解2.2.电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液陈旧3.3.所用电泳条件不合适所用电泳条件不合适4.4.DNADNA上样量过多上样量过多5.5.DNADNA样含盐过高样含盐过高6.6.有蛋白污染有蛋白污染7.7.DNADNA变性变性1.1.避免核酸酶污染避免核酸酶污染2.2.电泳缓冲液多次使用后，离子强度电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，降低，pHpH值上升，缓冲能力减弱，值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液电泳缓冲液3.3.电泳时电压不应超过电泳时电压不应超过20V/cm20V/cm，温温度度3030；巨大；巨大DNADNA链电泳，温链电泳，温度应度应1515；核查所用电泳缓冲液；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力是否有足够的缓冲能力4.4.减少凝胶中减少凝胶中DNADNA上样量上样量5.5.电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐6.6.电泳前酚抽提去除蛋白电泳前酚抽提去除蛋白7.7.电泳前勿加热，用电泳前勿加热，用20mM 20mM NaClNaCl缓缓冲液稀释冲液稀释DNADNADNADNADNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析q问题一：问题一：DNADNA带模糊带模糊 原原因因对对策策1.1.对于对于/HinHind IIId III片段片段coscos位位点复性点复性2.2.电泳条件不合适电泳条件不合适3.3.DNADNA变性变性1.1.电泳前于电泳前于6565加热加热DNA 5DNA 5分钟，然分钟，然后在冰上冷却后在冰上冷却5 5分钟分钟2.2.电泳电压不超过电泳电压不超过20V/cm20V/cm；温度温度3030；经常更换电泳缓冲液；经常更换电泳缓冲液3.3.以以20mM 20mM NaClNaCl Buffer Buffer稀释稀释DNADNA，电电泳前勿加热泳前勿加热q问题二：问题二：不规则不规则DNADNA带迁移带迁移对对策策 原原因因DNADNADNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析1.1.DNADNA的上样量不够的上样量不够2.2.DNADNA降解降解3.3.DNADNA走出凝胶走出凝胶4.4.对于对于EBEB染色的染色的DNADNA，所所用光源不合适用光源不合适1.1.增加增加DNADNA的上样量；聚丙烯酰胺凝的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低上样量可适当降低2.2.避免避免DNADNA的核酸酶污染的核酸酶污染3.3.缩短电泳时间，降低电压，增强凝缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度胶浓度4.4.应用短波长（应用短波长（254nm254nm）的紫外光源的紫外光源q问题三：问题三：带弱或无带弱或无DNADNA带带对对策策 原原因因DNADNADNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析1.1.小小DNADNA带走出凝胶带走出凝胶2.2.分子大小相近的分子大小相近的DNADNA带带不易分辨不易分辨3.3.DNA DNA 变性变性4.4.DNADNA链巨大，常规凝胶链巨大，常规凝胶电泳不合适电泳不合适1.1.缩短电泳时间，降低电压，增强凝缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度胶浓度2.2.增加电泳时间，核准正确的凝胶浓增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度度3.3.电泳前请勿高温加热电泳前请勿高温加热DNADNA链，以链，以20mM 20mM NaClNaCl Buffer Buffer稀释稀释DNADNA4.4.在脉冲凝胶电泳上分析在脉冲凝胶电泳上分析q问题四：问题四：DNADNA带缺失带缺失对对策策 原原因因DNADNADNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析电泳常见问题分析成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验重组体筛选与鉴定重组体筛选与鉴定成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验 转化（转化（transformation)transformation)：是将异源是将异源DNADNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。领域的基本实验技术。重组质粒的转化重组质粒的转化成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验转化方法转化方法1 1、化学的方法、化学的方法(热击法热击法)；使用化学试剂（如；使用化学试剂（如CaClCaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体体DNADNA分子导入受体细胞；分子导入受体细胞；2 2、电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受、电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNADNA分子导分子导入受体细胞。入受体细胞。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验 大肠杆菌感受态细胞的制备、大肠杆菌感受态细胞的制备、重组质粒的转化及克隆的筛选与鉴定重组质粒的转化及克隆的筛选与鉴定 感受态细胞感受态细胞(competent cells):(competent cells):受体细胞经过一些特殊的方法（如Cacl2、Rucl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell)。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验原理目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。在一定条件下，经过连接后的片段与感受态细胞混合保温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体，即带有异源分子的受体细胞。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验实验步骤1.挑取一DH5单菌落于5ml LB培养液中37过夜培养 成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37振摇培养至OD600值达到0.5-0.6之间 成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验3.取50ml菌液置于离心管内，4 4500g离心5分钟成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验4.加入30ml,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验5.4 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验6.感受态细胞分装成200l的小份,暂且不用的贮存于-70可保存半年。取其中一份进行转化。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验7.向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上放置30分钟。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验8.将上述混合物转移到预热到42的水浴锅中，热休克90秒(不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却12分钟。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验9.向管内加入800ul的LB培养液。然后37 培养45分钟。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验10.取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验11.倒置平板于37 培养1216个小时。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验重组质粒的转化重组质粒的转化（热激法）（热激法）1、冰上融化感受态细胞；2、将10ul连接产物加入到100ul感受态细胞，冰浴40min；3、42热激90s，勿摇动！4、热激后立马放置冰上1-2min；5、加400ulLB液体培养基，置摇床，37，70-100rpm 1h；6、涂平板。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验四、实验注意事项为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度:细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。3.试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验试剂：1.LB固体和液体培养基。2.含特定抗生素的LB固体培养基。3.100mM CaCl2溶液。4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。5.待转化质粒。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验克隆的筛选与鉴定克隆的筛选与鉴定 不同抗生素基因筛选不同抗生素基因筛选 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验一、抗药性标记及其插入失活选择法一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和和Ampr。Tetr上有插入位点上有插入位点BamH I和和Sal I;Ampr上有插入位点上有插入位点Pst I。一一 载体表型选择法载体表型选择法1.原理：原理：成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验（1）四环素：）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：）氨苄青霉素抗性基因：产生产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘霉酮酸，使碘-青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（）（蓝灰色）褪色。蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：）环丝氨酸：成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验3.选择过程：选择过程：如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四导致四环素抗性基因失活，可用环素抗性基因失活，可用四环素加环四环素加环丝氨酸丝氨酸平板培养基选择重组克隆。平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验无环丝氨酸培养基无环丝氨酸培养基成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素青霉素指示液选择。指示液选择。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表达产物表达产物特性进行直特性进行直接选择。（只在特定条件下）。接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。体菌株的突变型缺陷。一、原理：一、原理：二二 根据插入基因的表型选择根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷弥补缺陷his-his+受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含组氨酸的在不含组氨酸的培养基中生长培养基中生长成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验小鼠的二轻叶酸还原酶（小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。苄二氨嘧啶有抗性。DHFR载体载体连接连接转化受转化受体菌体菌三甲氧苄二氨嘧三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板啶培养基平板含含DHFR的克隆才能生长的克隆才能生长例：例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2.增加新性状增加新性状成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验利用有插入片段的重组载体的分子量比利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、中分离质粒，电泳、比较其分子量。比较其分子量。三三 DNA电泳检测法电泳检测法 分子量分子量 Marker载体载体重重组组克克隆隆成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验二、酶切电泳筛选法二、酶切电泳筛选法1.原理：原理：根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。否符合预计的结果。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验ABA或或B成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验筛选过程筛选过程筛选过程筛选过程成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验三、三、PCR扩增检测法扩增检测法1.原理原理PCR能在模板序列上扩增出预期能在模板序列上扩增出预期DNA片断。片断。2.过程过程（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。）。（2）用外源）用外源DNA插入片断引物作插入片断引物作PCR。（3）电泳）电泳PCR产物。产物。（4）检查是否有）检查是否有PCR产物。产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。产物的长度是否与外源基因一致。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验1.核酸核酸杂交杂交四四 核酸杂交检测法核酸杂交检测法 一、原理：一、原理：重组克隆与探针杂交。重组克隆与探针杂交。3.识别标记识别标记32P 或或 125I。（1）放射性同位素）放射性同位素2.检测用的探针检测用的探针与外源与外源DNA插入片断互补的序列。插入片断互补的序列。（2）非放射性标记）非放射性标记荧光素荧光素成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验二、核酸杂交检测方法二、核酸杂交检测方法用用DNA（或（或RNA）探针检测探针检测DNA样品。样品。1.Southern blotting从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取DNA（或质粒载或质粒载体），再用探针杂交。体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。与探针杂交，在底片上曝光显示。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验酶切前酶切前酶切后酶切后插入片断插入片断载体载体成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验Southern blot 筛选筛选结果结果成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验（1）原位杂交筛选）原位杂交筛选特点：特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。可以直接找出阳性菌落。成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验成都医学院成都医学院-生化与分子生物实验生化与分子生物实验（2）R-环检测法环检测法DNA-RNA杂交。杂交。1）原理：）原理：2）选择过程）选择过程在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA双链变性，复双链变性，复性的时候，性的时候，DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种双链更稳定。电镜下可见一种R-环环形结构。形结构。用