神经胶质细胞系衍生神经营养因子和雄激素受体在手术诱导隐睾小鼠睾丸管周细胞中的表达.pdf
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1、第 45卷 第1期2024 年 1月Vol.45 No.1January 2024中山大学学报(医学科学版)JOURNAL OF SUN YATSEN UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)神经胶质细胞系衍生神经营养因子和雄激素受体在手术诱导隐睾小鼠睾丸管周细胞中的表达吴飞1,2,潮敏1,2,张殷1,张晔1,蒋加斌1(1.安徽医科大学附属省儿童医院泌尿外科,安徽 合肥 230051;2.安徽医科大学第五临床医学院泌尿外科,安徽 合肥 230051)摘要:【目的】探讨神经胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)和雄激素受体(AR)在隐睾症小鼠睾丸管周细胞中的表达水平及对隐睾症导致
2、生精功能障碍的理论意义。【方法】30只5周龄雄性ICR小鼠采用随机数字表法随机分配至6组中,随机抽取3组15只小鼠进行手术诱导隐睾,其余3组为作为对照组进行假手术处理。分别于4 d、7 d、14 d后取各组睾丸组织,然后测量睾丸体积、观察睾丸组织病理,提取各组睾丸管周细胞后利用免疫荧光、Real-Time PCR和蛋白质印记法检测AR和GDNF的mRNA和蛋白的表达。【结果】对照组4 d、7 d、14 d小鼠的睾丸体积分别为(125.5819.22)mm3、(123.4520.12)mm3、(140.0913.62)mm3;睾丸各级生精细胞排列整齐、层次清楚,可见较多精子细胞,生精小管周围管周
3、细胞形态规则,呈梭形围绕小管周围,细胞厚度均一;ARmRNA的表达量分别为1.000.05、1.060.07、1.190.13GDNFmRNA的表达量分别为1.000.04、1.090.05、1.100.07;AR蛋白的表达量分别为 1.010.01、0.790.02、1.010.04;GDNF蛋白的浓度分别为(18.680.43)pg/mL、(14.390.36)pg/mL、(16.880.37)pg/mL。隐睾组4 d、7 d、14 d小鼠的睾丸体积分别为(115.643.91)mm3、(69.5114.97)mm3、(44.865.56)mm3;睾丸各级生精细胞排列紊乱、层次不清、结构破
4、坏,曲细精管周围管周细胞萎缩、弯曲断裂;ARmRNA的表达量分别为0.760.06、0.530.04、0.290.02;GDNFmRNA的表达量分别为0.720.05、0.420.02、0.300.03;AR蛋白的表达量分别为 0.540.02、0.980.04、0.310.01;GDNF 蛋白的浓度分别为(8.500.34)pg/mL、(17.440.32)pg/mL、(6.830.34)pg/mL。上述指标与对照组相比,除了4 d的睾丸体积差异无统计学意义(P0.05),其他均有统计学差异(P0.05),隐睾组3个时间点的睾丸体积、AR和GDNF的mRNA、蛋白表达量呈逐渐下降趋势且各组之
5、间的差异均有统计学意义(P0.05)。【结论】在手术诱导隐睾小鼠中,睾丸管周细胞的AR和GDNF的表达水平随着诱导时间的延长呈现显著下降。AR和GDNF在隐睾症介导睾丸管周细胞功能的损伤中有重要作用。本研究为阐明隐睾症导致生精功能障碍的机制研究提供理论基础。关键词:隐睾症;管周细胞;胶质细胞系衍生神经营养因子;雄激素受体中图分类号:R726.9 文献标志码:A 文章编号:1672-3554(2024)01-0085-08DOI:10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).20240004.020Expression of GDNF and AR in Tes
6、ticular Peritubular Cells of Surgery-induced Cryptorchidism MiceWU Fei1,2,CHAO Min1,2,ZHANG Yin1,ZHANG Ye1,JIANG Jiabin1(1.Department of Urology,Anhui Provincial Childrens Hospital Affiliated to Anhui Medical University,Hefei 230051;2.Department of Urology,The Fifth Clinical Medical College of Anhui
7、 Medical University,Hefei 230051)Correspondence to:CHAO Min;E-mail: 基础研究 收稿日期:2023-09-12 录用日期:2023-12-03基金项目:安徽省高校自然科学重点项目(2023AH050665)作者简介:吴飞,第一作者,研究方向:小儿泌尿外科,E-mail:;潮敏,通信作者,硕士生导师,主任医师,教授,研究方向:小儿泌尿外科,E-mail:第45卷中山大学学报(医学科学版)Abstract:【Objective】To investigate the expression of glial cell line-deri
8、ved neurotrophic factor(GDNF)and androgen receptor(AR)in testicular peritubular cells(TPCs)of cryptorchidism mouse models and explore the theoretical significance of cryptorchidism-induced spermatogenesis dysfunction.【Methods】A total of 30 five-week-old male ICR rats were divided randomly by using r
9、andom number table method into 6 groups.Cryptorchidism was surgically induced in 3 randomly selected groups and the other 3 groups underwent sham surgery as the control groups.On days 4,7 and 14 after surgery,we harvested the mice testes of the 3 groups and their corresponding control groups,then me
10、asured the testicular volumes,analyzed the testicular histopathology and detected the mRNA and protein expression levels of AR and GDNF in TPCs by immunofluorescence,real-time PCR and Western blot.【Results】In normal control groups,on days 4,7 and 14 after surgery,the testicular volumes were(125.5819
11、.22)mm3,(123.4520.12)mm3,(140.0913.62)mm3,respectively.Clear layers of spermatogenic cells were well arranged and abundant sperm cells were found.Peritubular cells were morphologically homogeneous,with slim-spindle appearance and normal cell thickness.The mRNA expression levels of AR were 1.000.05,1
12、.060.07 and 1.190.13;GDNF mRNA 1.000.04,1.090.05,and 1.100.07.The protein expression levels of AR were 1.010.01,0.790.02 and 1.010.04;GDNF protein(18.680.43)pg/mL,(14.390.36)pg/mL and(16.880.37)pg/mL.In cryptorchidism groups,on days 4,7 and 14 after surgery,the testicular volumes were(115.643.91)mm3
13、,(69.5114.97)mm3 and(44.865.56)mm3,respectively.Spermatogenic cells were disorganized,seminiferous tubules were disrupted,peritubular cells shrank,bent and fractured.The mRNA expression levels of AR were 0.760.06,0.530.04,and 0.290.02;GDNF mRNA 0.720.05,0.420.02 and 0.300.03.The protein expression l
14、evels of AR were 0.540.02,0.980.04 and 0.310.01;GDNF protein(8.500.34)pg/mL,(17.440.32)pg/mL and(6.830.34)pg/mL.Statistically significant differences(P 0.05).Testicular volumes,AR and GDNF mRNA and protein expression in control groups had no statistically significant difference(P 0.05),while those i
15、n cryptorchidism groups showed a trend of gradual decline in the amount and the differences between groups were statistically significant(P 0.05).【Conclusions】In surgery-induced cryptorchidism mice,after the induction,the expression of AR and GDNF in TPCs showed a gradual decrease over time.AR and G
16、DNF play a major role in mediating the TPCs damage in cryptorchidism.This study provides a theoretical basis for mechanism researches of cryptorchidism-induced spermatogenesis dysfunction.Key words:cryptorchidism;testicular peritubular cells(TPCs);glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF);an
17、drogen receptor(AR)J SUN Yatsen Univ(Med Sci),2024,45(1):85-92隐睾症是男孩中最常见的先天性泌尿生殖系统异常,不仅影响男性性腺的发育,还会对男性生育力产生影响1。而精子的产生依赖精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSC)的自我更新和向精原细胞的分化2,但影响SSC自我更新和分化为精原细胞的因素仍不清楚。睾丸组织中各种类型细胞之间复杂的通信网络维持了睾丸的正常结构和精子的产生3-4。支持细胞和管周细胞为SSC提供了一个有利于自我更新的微环境5-8,我们一直认为支持细胞是维持睾丸结构和促进精子产生的主要细胞9
18、。但近年来研究显示睾丸管周细胞(testis peritubular cell,TPC)在睾丸中也起着重要作用10,主要负责通过周期性的收缩和松弛来推动睾丸内的精子11。在对人类不育症患者TPC的研究中发现TPC可能是导致不育的中介并在其中扮演重要角色,而在大鼠睾丸中观察到TPC萎缩,肌动蛋白丝变薄、断裂,TPC弯曲,内膜增厚12。青春期前和青春期后的隐睾的人类睾丸中TPC发育不良和萎缩13,但隐睾症对TPC的分泌和收缩功能损伤的分子机制有待进一步研究。因精子受损而患有不育症的男性中TPC所表达的典型蛋白水平降低甚至消失14-15,这提示TPC平滑肌样表型的改变与精子损伤和男性不育有关。同时T
19、PC还具有分泌功能,其分泌的胶质细胞系来源的神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)在体外对促进 SSC 的维持、增殖和自我更新扮演重要角86第1期吴飞,等.神经胶质细胞系衍生神经营养因子和雄激素受体在手术诱导隐睾小鼠睾丸管周细胞中的表达色16。但TPCs的收缩和分泌功能是如何调节的尚不清楚,有研究在TPC上检测到雄激素受体(androgen receptor,AR)的表达,这提示雄激素可能参与其功能的调节17。在本研究中,我们通过建立一个人工隐睾小鼠模型,旨在探索关于隐睾导致TPC收缩和分泌功能损伤的机制。根据以上观测结
20、果我们推测隐睾症通过影响AR和GDNF的表达介导了TPC的收缩和分泌功能的损伤进而导致生精功能障碍。我们通过确定隐睾小鼠睾丸分离出的TPC所表达的AR蛋白和mRNA水平以及分泌的GDNF蛋白和mRNA水平变化来验证这一假设。1 材料与方法1.1实验材料1.1.1实验动物及分组选取 5 周龄 SPF 级雄性ICR 小鼠 30 只【SCXK(京)2019-0008】,体质量2025 g,各小鼠生活环境为 12 h 白 12 h 黑,温度221,湿度45%55%,自由进食饮水。适应性喂养1周后利用随机数字表法随机分配至6组中(n=5),随机抽取 3个组的 15只小鼠进行手术诱导隐睾,其余3个组为作为
21、对照组进行假手术处理。将隐睾组和对照组随机进行配对,分别于手术诱导隐睾4 d、7 d、14 d后处死隐睾组及对照组小鼠(每个时间点每组5只)。本研究已获得安徽医科大学实验 动 物 伦 理 委 员 会 的 批 准(批 文 编 号 为LLSC20231241)。1.1.2实验主要试剂和仪器主要试剂:Percoll溶液(Biosharp,中国)、DMEM/F12 基础培养基(Biosharp,中国)、TRIpure裂解酶(BioTeke,北京)、-SMA antibody(CST,美 国)、tritonX-100(Beyotime,中国)、BeyoRT M-MLV反转录酶(碧云天,上海)、全蛋白提取
22、试剂盒(wanleibio,中国)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(wanleibio,中国)、AR antibody(ABclonal,中 国,1:500)、-actin antibody(wanleibio,中国,1:1 000)、羊抗兔 IgG-HRP 二抗(wanleibio,中国,1:5 000)、Mouse GDNF ELISA Kit(武汉菲恩,中国)。主要仪器:电热恒温培养箱DH36001B(天津泰斯特,天津)、尼康I90显微镜(尼康,东京,日本)、BX53 显微镜(OLYMPUS,日本)Exicycler 96 PCR荧光定量仪(BIONEER,韩国)、超速冷冻离心机H-2050R
23、(湖南湘仪,长沙)、紫外分光光度计NANO 2000(Thermo,美国)。1.2实验方法1.2.1隐睾小鼠模型的制备及睾丸体积的测量麻醉小鼠后,对左下腹皮肤进行消毒。切开腹腔后,将左侧睾丸拉入腹腔,缝合至腹壁,将左侧睾丸固定在腹腔内。对照组小鼠在打开腹腔后,轻轻拉动左侧睾丸,使其留在阴囊原位置。两组均未对右侧睾丸进行处理。分别于术后4、7、14 d后取小鼠睾丸,用游标卡尺分别测量睾丸的长、宽、高,并按照算式 V=1/4DLK 计算睾丸体积。其中,D为宽、高的平均数,L为长,K为系数0.9。1.2.2睾丸组织学分析对照组和手术诱导的隐睾小鼠睾丸组织固定于Bouins溶液中,石蜡包埋。睾丸切片,
24、厚度为7 m,分离,复水。睾丸切片用红木精和伊红(HE)染色。在脱水和包埋后,在显微镜下观察睾丸管周细胞和精子的形态。1.2.3睾丸管周细胞的提取将108个细胞混合液在 DMEM/F12 中复苏,施加到 Percoll 梯度的顶部,然后进行离心,离心时间为 20 min,转速为800 r/min,r=8 cm。将 Percoll溶液与 DMEM/F12混合,得到 20%60%(每级相差 5%)Percoll 梯度溶剂。Percoll-DMEM/F12溶液加入15 mL管中,得到9 层梯度。离心后,大多数 PM 细胞位于 35%40%Percoll界面。用 2-平滑肌肌动蛋白(ACTA2)抗体染
25、色细胞,评价其纯度。使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养管周细胞2 d,更换无血清培养液培养,第 3 d收集细胞用于检测AR和GDNF的mRNA的表达。第7 d收集细胞用于检测AR和GDNF的蛋白表达。1.2.4免疫荧光评估管周细胞纯度40 g/L 多聚甲醛固定细胞爬片 15 min,再用 0.1%tritonX-100进行透膜,1%BSA 封闭,按抗体说明浓度滴加一抗-SMA,4 孵育过夜,次日滴加 Cy3标记山羊抗兔IgG二抗(1:200)孵育,用抗荧光淬灭剂封片,荧光显微镜下及时观察,照相。1.2.5Real-Time PCR 检测 AR 和 GDNF 的表达用 Trizol
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