基于Nrf2信号通路探究参...亡对酒精性肝损伤大鼠的影响_周相宇.pdf

第 29 卷第 5 期2023年 3 月Vol.29，No.5Mar.，2023中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae基于 Nrf2信号通路探究参苓白术散调节铁死亡对酒精性肝损伤大鼠的影响周相宇1，周素芳1，2*，李玉茹1，蔡世揿1，廖佳佳1，叶佐玉1（1.贵州中医药大学 第一临床医学院，贵阳 550002；2.贵州中医药大学 第一附属医院，贵阳 550001）摘要 目的：观察参苓白术散通过调节核因子 E2相关因子 2（Nrf2）信号通路的干预调节铁死亡对酒精性肝损伤大鼠的影响。方法：将 40只 SD大鼠随机分为模型组、多烯磷脂酰胆碱组、参苓白术散高、中、低剂量组，每组 8只，另取 8只 SD大鼠作为正常组。模型组、多烯磷脂酰胆碱组、参苓白术散高、中、低剂量组予以 10 mL kg-1灌胃造模，正常组予以等体积蒸馏水灌胃；每日灌酒 4 h后，予以多烯磷脂酰胆碱组 143.64 mg kg-1药物灌胃、参苓白术散高、中、低剂量组分别予以 15、7.5、3.75 mg kg-1的药物，正常组与模型组予以等体积蒸馏水灌胃，灌胃连续 6周。全自动生化仪检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、谷氨酰转肽酶（GGT）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测肿瘤坏死因子-（TNF-）、白细胞介素-1（IL-1）水平，生化检测法检测脂多糖（LPS）、丙二醇（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、铁离子（Fe+）水平，苏木素-伊红（HE）和油红 O染色观察肝脏病理变化，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测 Nrf2、血红素加氧酶-1（HO-1）、谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）、铁蛋白重链 1（FTH1）、核转录因子-B（NF-B）mRNA 表达，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测 Nrf2、HO-1、GPX4、FTH1、p65、磷酸化（p）-p65蛋白表达。结果：与正常组比较，模型组肝功能（ALT、AST、GGT）、血脂（TC、TG）水平明显升高（P0.05），肝脏出现明显脂肪变性，有大量脂肪沉积，氧化应激水平及炎症因子明显升高（P0.05），Fe+水平明显增高（P0.05），Nrf2、HO-1、GPX4、FTH1 蛋白表达明显下调（P0.05），p65、p-p65 蛋白表达明显上调（P0.05），Nrf2、HO-1、GPX4、FTH1 mRNA 表达明显下调（P0.05），NF-B mRNA 表达明显上调（P0.05）；与模型组比较，参苓白术散高、中剂量组肝功能（ALT、AST、GGT）、血脂（TC、TG）水平明显下调（P0.05），肝脏脂肪变性明显改善，脂肪沉积明显减少，氧化应激水平以及炎症因子明显降低（P0.05），Fe+水平明显降低（P0.05），Nrf2、HO-1、GPX4、FTH1蛋白表达明显上调（P0.05），p65、p-p65蛋白表达明显下调（P0.05），Nrf2、HO-1、GPX4、FTH1 mRNA表达明显上调（P0.05）、NF-B mRNA表达明显下调（P0.05）。结论：参苓白术散能够有效减少ALD大鼠肝损伤，调节脂肪变性与脂肪沉积，并在肝脏内发挥抗氧化与抗炎作用；其作用机制可能与上调Nrf2信号通路改善氧化应激的途径抑制肝细胞内铁死亡发生有关。关键词 参苓白术散；酒精性肝损伤；核因子 E2相关因子 2（Nrf2）；氧化应激；铁死亡中图分类号 R2-0；R22；R285.5；R289；R33 文献标识码 A 文章编号 1005-9903（2023）05-0104-10doi 10.13422/ki.syfjx.20221907 网络出版地址 https:/ 2022-10-19 11:55:09Effect of Shenling Baizhusan on Alcoholic Liver Injury in Rats by Regulating Ferroptosis Based on Nrf2 Signaling PathwayZHOU Xiangyu1，ZHOU Sufang1，2*，LI Yuru1，CAI Shiqin1，LIAO Jiajia1，YE Zuoyu1（1.The First Clinical Medical College of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine（TCM），Guiyang 550002，China；2.First Affiliated Hospital of Guizhou University of TCM，Guiyang 550001，China）收稿日期 2022-07-31基金项目 国家自然科学基金项目（81460683）；贵州省科技项目计划项目（黔科合支撑 2021 一般 015）第一作者 周相宇，在读硕士，从事中医药防治肝病、脾胃病研究，E-mail：通信作者 *周素芳，博士，主任医师，教授，博士生导师，从事中医药调节肠道微生态及保护肠黏膜、肝脾相关理论在消化系统运用的基础及临床研究，E-mail： 药理 104第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023Abstract Objective：To observe the effect of Shenling Baizhusan on the intervention of the nuclear factor erythroid 2-related factor 2（Nrf2）signaling pathway by regulating ferroptosis in rats with alcoholic liver injury.Method：Forty SD rats were randomly divided into model group，polyene phosphatidylcholine group，and high，medium，and low-dose Shenling Baizhusan groups，with 8 rats in each group.Another 8 SD rats were taken as blank group.The model group，polyene phosphatidylcholine group，high，medium，and low-dose Shenling Baizhusan groups were given 10 mL kg-1 liquor by gavage for modeling，and the blank group was given equal volume of distilled water by gavage.After 4 h of daily alcoholic administration，143.64 mg kg-1 of polyene phosphatidylcholine group was given to the polyene phosphatidylcholine group，15，7.5，3.75 mg kg-1 of Shenling Baizhusan were given to Shenling Baizhusan high，medium，and low-dose groups，respectively，and the blank group and the model group were given equal volume of distilled water.The gavage lasted for 6 weeks.The levels of alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），glutamyl transpeptidase（GGT），total cholesterol（TC），and triglyceride（TG）were detected by automatic biochemical analyzer.The levels of tumor necrosis factor-（TNF-）and interleukin-（IL-）were detected by the enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The levels of lipopolysaccharide（LPS），malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD），glutathione（GSH），and Fe+were detected by biochemical assay.The pathological changes in the liver were observed by hematoxylin-eosin（HE）staining and oil red O staining.The mRNA expression levels of Nrf2，heme oxygenase-1（HO-1），glutathione peroxidase 4（GPX4），ferritin heavy polypeptide 1（FTH1），and nuclear factor-B（NF-B）were detected by Real-time polymerase chain reaction（Real-time PCR）.The protein expression levels of Nrf2，HO-1，GPX4，FTH1，p65，and phosphorylation（p）-p65 were detected by Western blot.Result：As compared with the blank group，the levels of liver function（ALT，AST，and GGT）and blood lipids（TC and TG）in the model group were significantly increased（P0.05）.The liver showed obvious steatosis，with a large number of fat deposition，the oxidative stress and inflammatory factors were significantly increased（P0.05），and the level of Fe+was significantly increased in model group（P0.05）.The protein expression levels of Nrf2，HO-1，GPX4，and FTH1 was significantly down-regulated（P0.05），and those of p65 and p-p65 was significantly up-regulated in the model group（P0.05）.The mRNA expression levels of Nrf2，HO-1，GPX4，and FTH1 were significantly down-regulated（P0.05），and the mRNA expression level of NF-B was significantly up-regulated（P0.05）.As compared with the model group，the levels of liver function（ALT，AST，and GGT）and blood lipids（TC and TG）in the high-dose and medium-dose Shenling Baizhusan groups were significantly decreased（P0.05），liver steatosis was significantly improved，fat deposition was significantly reduced，oxidative stress and inflammatory factors were significantly decreased（P0.05），and Fe+level was significantly decreased（P0.05）.In the high-dose and medium-dose Shenling Baizhusan，the protein expression levels of Nrf2，HO-1，GPX4，and FTH1 were significantly up-regulated（P0.05），and those of p65，p-p65 were significantly down-regulated（P0.05）.The mRNA expression levels of Nrf2，HO-1，GPX4，and FTH1 were significantly up-regulated（P0.05），and the mRNA expression level of NF-B was significantly down-regulated（P0.05）.Conclusion：Shenling Baizhusan can effectively reduce liver injury in rats with ALD，regulate steatosis and fat deposition，and play an antioxidant and anti-inflammatory role in the liver.Its mechanism may be related to the inhibition of ferroptosis in hepatocytes by up-regulating the Nrf2 signaling pathway to improve oxidative stressKeywords Shenling Baizhusan；alcoholic liver injury；nuclear factor erythroid 2-related factor 2（Nrf2）；oxidative stress；ferroptosis酒精性肝病（ALD）是指由于长期摄入酒精导致肝细胞损伤，进而引发的一系列肝脏相关疾病，其疾病进展共分为酒精性脂肪肝，酒精性肝炎，酒精诱导的肝纤维化，酒精诱导的肝硬化及酒精诱导的肝癌 5 个阶段1。据相关数据统计表明，2016 年全球约有 33.4 万人死于酒精性肝硬化和酒精所诱105第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023导的慢性肝病，此外，死于与酒精相关的肝癌人数占肝癌死亡人数总量的 30%2。近年来随着我国经济的发展，酒精消费增加，导致酒精性肝病患病率不断增长，并且逐渐呈年轻化，对我国经济和公共卫生造成了严重负担3。ALD 发病机制复杂，涉及乙醇代谢、细胞死亡、氧化应激、免疫调节、脂肪变性等多个方面4-6。铁死亡是一种新型细胞死亡方式，当细胞内铁代谢出现紊乱，铁通过芬顿反应产生活性氧（ROS），消耗细胞内的谷胱甘肽（GSH），降低谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）活性，阻碍脂质过氧化物代谢，最终诱发铁死亡7-8。研究发现，肝脏内铁过量积累会加速铁死亡发生，加重细胞肝损伤9。中医学认为 ALD 发病乃因过度饮酒损伤脾胃，脾失健运，运化失司，湿热酒毒内蕴，气血淤阻，痰邪湿热互结，滞留于中焦，气机不畅，则肝郁气滞，最终形成脾虚肝郁之症。因此，治疗 ALD 当从脾胃论治10，难经 中便提出“实脾则肝自愈”的观点，见肝之病，当知传脾，以先安未受邪之地，阻断疾病传变途径，则邪无以传，病自愈。因此虽然 ALD 病位在肝，但其发病与脾胃密切相关，故治疗 ALD 多用健脾化湿、疏肝理气之法。参苓白术散出自 太平惠民和剂局方，作为健脾益气的经典名方，在现代临床应用及基础研究中被证实对肝病具有良好的调节作用11-13，充分体现了“见肝之病，当知传脾”及“实脾则肝自愈”的理论观点。现代药理发现参苓白术散能够通过调节多种信号通路改善不同的疾病，在基础研究中应用广泛14。在课题组前期研究表明，参苓白术散能够通过 下 调 Toll 样 受 体 4（TLR4）、髓 样 分 化 因 子 88（MyD88）等炎症信号改善酒精性肝病大鼠肝损伤，但更多相关机制尚未完全阐释14。因此，本研究拟通 过 观 察 参 苓 白 术 散 干 预 核 因 子 E2相 关 因 子 2（Nrf2）信号通路调节铁死亡对酒精性肝损伤的影响，对其作用机制进行深入探究。1 材料1.1动物 健康雄性 SD大鼠 48只（SPF级），8周龄大小，体质量（22020）g，购自湖南实验长沙天勤生物技术有限公司，实验动物合格证号 SCXK（湘）2019-0014。分笼饲养于室温（222）、12 h 光照昼夜交替的实验环境，不对饮食进行干预。本实验经贵州中医药大学实验动物伦理审查委员会批准，伦理审查批号 20210061。1.2药品 参苓白术散（白扁豆颗粒 15 g，批号20030194；白术颗粒 15 g，批号 21090124；茯苓颗粒18 g、批号 20060043，甘草颗粒 6 g、批号 20050054，桔梗颗粒 10 g、批号 20130013，莲子颗粒 18 g、批号20040106，人参颗粒 9 g、批号 19090194，砂仁颗粒3 g、批号 20080197，山药颗粒 30 g、批号 20090157，薏苡仁颗粒 18 g、批号 21100215，上述药材均使用颗粒剂型，厂家均为四川绿色药业科技有限公司；多烯磷脂酰胆碱胶囊（国药准字 H20059010，批号CBJD053，规格 228 mg/粒，赛诺菲制药有限公司）1.3试剂 红星二锅头（北京红星股份有限公司，批号 2021113008），-谷氨酰基转移酶（GGT）试剂盒、丙 二 醛（MDA）试 剂 盒、总 超 氧 化 物 歧 化 酶（SOD）试剂盒（WST-1 法）、GSH 试剂盒（微板法）、组织铁试剂盒（比色法）、内毒素试剂盒（鲎试剂法）（南京建成生物工程研究所，货号分别为 C017-2-1、A003-1-1，A001-3-、A006-2-1、A039-2-1、E039-1-1）；天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、甘油三酯（TG）试剂盒、总胆固醇（TC）试剂盒（长春汇力生物科技有限公司，货号分别为 C072-a、C073-a、C019-a、C048-a）；兔多克隆抗体 Nrf2、血红素加氧酶-1（HO-1）、铁蛋白重链 1（FTH1）、p65、磷 酸 化（p）-p65（Affinity Biosciences公 司，货 号 分 别 为 AF0639、AF5393、DF6278、AF2006、AF5006）；兔多克隆抗体 GPX4（ABclonal公司，货号 A13309）；兔多克隆抗体甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，杭州贤至生物有限公司，货号 AB-P-R 001）；蛋白 Marker（20120 kDa）（GenScript 公司，货号 M00521）；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗小鼠二抗、HRP 标记羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有限公司，货号分别为 BA1051、BA1054）；TRIzol（Ambion公司，批号 15596-026）；HiScript Q RT SuperMix（+gDNA wiper）（Vazyme公司，批号R223-01）；大鼠肿瘤坏死因子-（TNF-）、大鼠白细胞介素-1（IL-1）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂 盒（科 鹿 生 物 科 技 由 限 公 司，货 号 分 别 为ELK1396、ELK1272）；苏木素（美国 Sigma 公司，货号 H9627）；伊 红 Y（水 溶 性）（国 药 集 团，货 号71014544）。1.4仪器 H1-16 KR 型台式高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司），Multiskan FC 型酶标仪（美国 Thermo Scientific 公司），Chemray240 型全自动生化分析仪（Rayto 公司），Tissulyser-24 型组织研磨器（上海净信公司），EDC-810 型 PCR 仪（东胜创新生物科技有限公司）；JY300型水平电泳仪、JY02S106第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023型紫外分析仪（北京君意东方电泳设备有限公司），DYCZ-24DN 型垂直电泳槽（北京六一仪器厂）；SH-523型化学发光成像系统（杭州申花科技有限公司）2 方法2.1ALD 造模及给药 将 48 只 SD 大鼠适应性喂养 1 周后，参考文献 16-17 造模，将 48 只大鼠随机分为 6 组：正常组、模型组、参苓白术散高、中、低剂量组、多烯磷脂酰胆碱组，每组 8只。ALD模型组每日上午 10点予以 56 C白酒灌胃（10 mL kg-1），正常组予以等体积蒸馏水灌胃，在造模的同时予以药物干预。ALD 模型组大鼠高度白酒灌胃 4 h 后，参苓白 术 散 高、中、低 剂 量 组 分 别 予 以 15、7.5、3.75 mg kg-1的药物灌胃，多烯磷脂酰胆碱组予以143.64 mg kg-1多烯磷脂酰胆碱胶囊灌胃，正常组与模型组予以同体积的蒸馏水灌胃（所有剂量均根据实验动物学 剂量进行等效剂量换算，参照 60 kg成人剂量），每日高度白酒灌胃造模1次，给药1次，连续6周。ALD 模型大鼠白酒灌胃造模采用梯度递增剂量灌胃，造模前 3 d予以 4 mL kg-1高度白酒灌胃，第47天予以6 mL kg-1，第7天后予以10 mL kg-1。2.2标本采集 末次造模给药结束后，所有大鼠禁食禁食 12 h，予以腹腔注射麻醉，从腹主动脉取得血样标本 5 mL；使用过量麻醉安乐死大鼠，冰上操作收集肝脏标本，并将肝脏标本分为 3部分，取相同部位肝脏组织 2 块分装置于 4%多聚甲醛溶液固定保存；剩余 1块同部位肝脏组织置于-80 C冰箱保存。2.3观察指标及方法 2.3.1肝功能、血脂、铁离子（Fe+）测定 取血操作同 2.2项进行，大鼠麻醉后腹主动脉穿刺采血，血样室温静置 20 min，室温 2 500 r min-1离心 20 min（离心半径 4.5 cm），收集标本上清液置于 5 mL 微型离心管内，使用全自动生化仪检查测 ALT、AST、GGT、TC、TG等指标。2.3.2炎症因子测定 取血操作同 2.3.1项进行，按照试剂盒使用说明操作测定炎症因子（LPS、TNF-、IL-1）水平。2.3.3氧化应激指标、铁离子测定 肝脏标本采集操作同 2.2，将收集的新鲜肝脏组织充分冰浴研磨，将 匀 浆 液 3 000 r min-1离 心 10 min（离 心 半 径4.5 cm），取上清检测，样本处理好后测蛋白浓度，根据试剂盒说明进行操作测定 MDA、SOD、GSH 和Fe+。2.3.4肝脏组织病理观察 苏木素-伊红（HE）染色：取大鼠同一部位肝脏组织 1 块，浸入 4%多聚甲醛溶液中固定 48 h，经组织脱水、包蜡切片后，HE染色，显微镜下观察肝脏病理变化；油红 O 染色：冰冻切片用甲醛-钙固定 10 min，蒸馏水洗；60%异丙醇浸洗，油红 O染液染 10 min；60%异丙醇分色至背景无色，蒸馏水洗；Mayer 苏木素复染数分钟，磷酸盐缓冲液（PBS）浸洗（蓝化）3 min；蒸馏水洗后水溶性封片剂封片，显微镜下观察肝脏病理变化。2.3.5实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测相关 mRNA 表达情况 取-80 冰箱中保存的新鲜冰冻肝脏组织，加入 TRIzol试剂 1 mL，用匀浆器研磨成浆，移至无 RNase的 1.5 mL 微型离心管中，裂解 10 min；加入三氯甲烷 200 L，剧烈颠倒 混 匀 数 次，室 温 放 置 5 min；低 温（4 ）12 000 r min-1离心 8 min（离心半径 13.5 cm，下同）；转移上层水相（约 400 L）于 1.5 mL微型离心管中，加入异丙醇 400 L，混匀后室温静置 10 min；低温（4）12 000 r min-1离心 10 min；弃上清，加入无RNase 的 75%乙醇 1 mL，涡旋混匀后，低温（4）10 000 r min-1离心 5 min；弃上清，空气中干燥 RNA沉淀 510 min，将沉淀溶于 DEPC 20 L 水中；取溶解后的 RNA 2 L 用微量分光光度计测定吸光度A260、A280及 A260/A280值，计算 RNA 的纯度和浓度；将总 RNA 放于-80 冰箱内保存以备用。使用逆转录 反 应 体 系 合 成 cRNA，并 使 用 Real-time PCR 扩增，根 据 基 因 序 列 设 计 引 物。引 物 具 体 序 列见表 1。2.3.6蛋白免疫印迹法（Western blot）检测蛋白表达 将肝脏组织剪碎后放入 2 mL 微型离心管中进表 1引物序列Table 1Primer sequence引物-actinNrf2HO-1GPX4FTH1NF-B序列（5-3）上游 CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC下游 TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT上游 ACCTAAAGCACAGCCAACA下游 TCTTCCCTCTCCTGCGTAT上游 GAAACAAGCAGAACCCAGTC下游 AGAGGTCACCCAGGTAGCG上游 ATTCCCGAGCCTTTCAACC下游 ACGCAACCCCTGTACTTATCC上游 CCAGCGAGGTGGACGAATC下游 CAGGGTGTGCTTGTCAAAGAGAT上游 GCATTCTGACCTTGCCTATC下游 TCCAGTCTCCGAGTGAAGC长度/bp240347225182304183107第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023行清洗，然后每管加入裂解液 200 L置于自动匀浆机中匀浆；匀浆完成后将 EP 管置于冰上充分裂解30 min；将裂解液移至 1.5 mL微型离心管中，在 4 C下使用 12 000 r min-1离心 5 min。将提取的蛋白上清与 5蛋白上样缓冲液（体积比按照 4 1 混合），放入沸水中进行沸水浴 10 min 将蛋白变性。将总蛋白量 40 g 的样本分别上样后进行电泳 60 min；电泳完成后根据 Marker 位置使用 PVDF 膜进行电转移；使 用 含 5%脱 脂 奶 粉 的 TBST（封 闭 液）浸 泡PVDF 膜室温摇床封闭 2 h；用封闭液稀释相应的一抗，使 PVDF 膜浸泡于一抗孵育液中，4 孵育过夜；TBST充分洗涤 PVDF膜 5次，用 TBST稀释标记HRP 的二抗（1 10 000），使 PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育 2 h；TBST充分洗涤 PVDF膜5 次，将 ECL 试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按 1 1比例混匀，滴加工作液于 PVDF 膜上，反应数分钟待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片。晾干胶片，扫描胶片，用 IPP分析胶片灰度值。2.4统计学方法 采用 Graphpad Prism 8.0 软件对所得数据结果分析，结果使用x s表示，组间比较采用单因素方差分析，多组间比较使用多重比较分析，以 P0.05表示差异有统计学意义。3 结果3.1对 ALD大鼠肝脏病理的影响 3.1.1肝脏 HE 染色 正常组肝细胞形态结构完整，肝细胞轮廓清晰，间质内未见纤维化增生，未见炎性细胞浸润；模型组肝细胞形态结构完整，大量肝细胞核消融固缩，视野内所有肝实质肝细胞脂质样变性，胞质浅染，间质内未见纤维化增生，未见炎性细胞浸润；参苓白术散低剂量组肝细胞形态结构完整，大量肝细胞核消融固缩，肝实质大量肝细胞脂质样变性，胞质浅染，间质内未见纤维化增生，未见炎性细胞浸润，参苓白术散中剂量组肝细胞形态结构完整，少量肝细胞核消融崩解，肝实质肝细胞有脂质样变性，胞质浅染，间质内未见纤维化增生，未见炎性细胞浸润；参苓白术散高剂量组肝细胞形态结构完整，肝细胞轮廓清晰，少量肝血窦轻微扩张，局部肝血窦间质形成聚集性脂肪样变性，间质内未见纤维化增生，未见炎性细胞浸润；多烯磷脂酰胆碱组肝细胞形态结构完整，肝细胞轮廓清晰，肝间质肝血窦有少量肝血窦扩张，间质内未见纤维化增生，未见炎性细胞浸润。见图 1。3.1.2肝脏油红 O 染色 与正常组比较，模型组肝细胞的细胞质内视野内大量橘红色的脂滴，表明脂肪沉积严重；与模型组比较，参苓白术散低剂量组肝细胞的细胞质内脂滴减少，但视野内仍可见大量脂滴，参苓白术散中、高剂量组、多烯磷脂酰胆碱组肝细的胞细胞内脂滴可见明显减少。见图 2。注：A.正常组；B.模型组；C.多烯磷脂酰胆碱组；D.参苓白术散低剂量组；E.参苓白术散中剂量组；F.参苓白术散高剂量组（图 2 和图 3同）图 1参苓白术散对 ALD大鼠肝脏病理的影响（HE，200）Fig.1 Effect of Shenling Baizhusan on liver pathology in ALD rats（HE，200）图 2参苓白术散对 ALD大鼠肝脏病理的影响（油红 O，200）Fig.2 Effect of Shenling Baizhusan on liver pathology in ALD rats（Oil red O，200）108第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，20233.2对 ALD 大鼠肝功能、血脂的影响 与正常组比较，模型组大鼠 ALT、AST、GGT、TC、TG 等指标明显增高（P0.05）；与模型组比较，参苓白术散各剂量组、多烯磷脂酰胆碱组 ALT、AST、GGT、TC、TG等指标明显降低（P0.05），但参苓白术散低剂量组TG差异无统计学意义（P0.05）。见表 2。3.3对 ALD 大鼠炎症因子的影响 与正常组比较，模 型 组 大 鼠 LPS、TNF-、IL-1 明 显 增高，差异有明显统计学意义（P0.05）；与模型组比较，参 苓 白 术 散 各 组、多 烯 磷 脂 酰 胆 碱 组 LPS、TNF-、IL-1明显降低，差异有明显统计学意义（P0.05）。见表 3。3.4对 ALD 大鼠氧化应激及 Fe+的影响 与正常组比较，模型组大鼠 GSH、SOD 指标水平明显降低，MDA、Fe+含量明显增高（P0.05）；与模型组比较，参苓白术散高剂量组、多烯磷脂酰胆碱组 GSH、SOD 指标水平明显升高，MDA、Fe+含量明显降低（P0.05）。见表 4。3.5对 ALD 大鼠 Nrf2、NF-B 信号通路、铁死亡相关 mRNA 的 影 响 与 正 常 组 比 较，模 型 组 Nrf2、HO-1、GPX4、FTH1 mRNA 表达明显降低（P0.05），NF-B mRNA 表达明显增高（P0.05）；与模型组比较，参苓白术散中、高剂量组及多烯磷脂酰胆碱组Nrf2、HO-1、GPX4、FTH1 mRNA 表达明显升高（P0.05），NF-B mRNA 表 达 明 显 降 低（P0.05）。见表 5。3.6对 ALD 大鼠 Nrf2、NF-B 信号通路信号通路、铁死亡相关蛋白的影响 与正常组比较，模型组表 2参苓白术散对 ALD大鼠肝功能、血脂的影响（x s，n=8）Table 2Effect of Shenling Baizhusan on liver function and blood lipid in ALD rats（x s，n=8）组别正常组模型组多烯磷脂酰胆碱组参苓白术散低剂量组参苓白术散中剂量组参苓白术散高剂量组剂量/mg kg-1143.643.757.515ALT/U L-131.4607.30679.8706.7971）44.0404.4022）66.4305.2512）56.3008.9152）39.4805.0602）AST/U L-151.1108.336152.3008.4371）69.9707.4842）121.608.0272）90.5806.1112）61.5705.8342）GGT/U L-173.02018.620209.67019.4201）99.99012.9502）170.90012.1102）125.60012.7802）87.64013.3302）TC/mmol L-12.4690.6016.2370.5701）3.1300.5132）5.1040.5702）4.2990.5592）2.9610.5102）TG/mmol L-11.8440.5414.4320.5261）2.5010.4172）3.8410.4573.0900.5552）2.1700.3232）注：与正常组比较1）P0.05；与模型组比较2）P0.05（表 3-表 6同）表 3参苓白术散对 ALD大鼠炎症因子的影响（x s，n=8）Table 3Effect of Shenling Baizhusan on inflammatory factors in ALD rats（x s，n=8）组别正常组模型组多烯磷脂酰胆碱组参苓白术散低剂量组参苓白术散中剂量组参苓白术散高剂量组剂量/mg kg-1143.643.757.515LPS/U mL-10.7890.0891.6140.2711）0.9850.0752）1.3260.0812）1.0210.1262）0.8990.0602）TNF-/ng L-132.8604.12254.2605.9851）37.6707.8802）45.6403.5392）38.5604.2622）34.8203.2882）IL-/ng L-124.6603.47444.8505.0591）26.6103.3322）38.6303.7822）29.5903.8432）26.3504.0332）表 4参苓白术散对 ALD大鼠氧化应激及 Fe+的影响（x s，n=8）Table 4Effect of Shenling Baizhusan on oxidative stress and iron ion in ALD rats（x s，n=8）组别正常组模型组多烯磷脂酰胆碱组参苓白术散低剂量组参苓白术散中剂量组参苓白术散高剂量组剂量/mg kg-1143.643.7