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土壤微生物多样性研究中总DNA提取技术进展

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土壤微生物多样性研究中总DNA提取技术进展
摘要：综述了在土壤微生物多样性研究中总dna提取技术的研究进展，分析了dna提取过程中的主要影响因素及存在的问题。
关键词：土壤微生物；多样性；dna；提取技术
中图分类号:s154.3 文献标识码：a 文章编号：0439—8114（2012）23—5253—06
advances of total dna extraction technology for soil microbial diversity research
xiao bin,jiang dai—hua，liu li-long,liu quan-dong
（college of agronomy，guangxi university，nanning 530005，china）
abstract： the influencing factors and application aspects， as well as the potentials and limitations of dna extraction techniques for microbial diversity analysis were reviewed. applying appropriate methods to extract microorganism dna fragment that have right purity and appropriate size from soil were the precondition in soil microbial study on the molecular level, and the subsequent molecular biotechnology operations were all rely on these methods.
key words: soil microorganism； diversity； dna； extraction method
土壤微生物多样性是生物多样性研究的一个重要领域，是指其在遗传、种类、结构与生态功能方面的变化，对指示土壤微生物群落的稳定性，在保持土壤质量和生态系统稳定性等方面具有重要意义[1]，是当今国内外关注和研究的热点问题之一。
长期以来，由于研究方法的限制，传统的分离纯化培养技术仅能获得土壤中微生物总种群数的1％左右，而绝大部分微生物目前还不能获得纯培养［2]，未能获得纯培养的微生物才是土壤微生物的主体，因此,有关微生物多样性研究进展不大.
近年来，随着分子生物学技术的发展和研究手段的更新,基于土壤微生物群落总dna的现代微生物分子生态学研究方法避免了传统分离培养方法的缺点，被广泛应用于土壤微生物群落结构、功能以及动态监测研究[3］。因此作为微生物群落分子分析方法的基础，最重要的一步就是从土壤样品中尽量毫无偏差地提取出高质量的、具有代表性的微生物总基因组dna。关于土壤微生物dna提取方法的报道很多［4，5］，然而这些方法主要侧重于土壤中的细菌群落，很少关注土壤中真菌群落总基因组dna的提取方法及其提取效果.另外，细胞裂解不完全、dna分子吸附在样品基质颗粒的表面、从样品中同时提取了某些重要酶的活性抑制剂、dna分子的损耗、降解和破坏等因素也影响着土壤微生物dna提取的质量,因而提取土壤微生物总dna在研究中尤为重要[6].本文主要对dna提取过程中的主要影响因素、现行各方法的优缺点以及存在的问题作一综述。
1 基于dna方法的土壤微生物多样性研究现状
传统微生物学研究方法主要依赖于纯培养技术和显微镜技术，对土壤微生物多样性的描述与研究存在一定的局限性。20世纪中后期，随着土壤微生物多样性研究向多方面发展，人们尝试着利用分析微生物细胞中某种指示成分,如磷脂脂肪酸（plfa)来研究土壤微生物的种群组成，但是这些方法的缺陷是无法保证细胞中某种指示成分在土壤中的稳定性,并且如果某种微生物的plfa是未知的，则该不可培养微生物仍难以鉴别［7，8]。
1980年,torsvik等[9]首次建立了从土壤样品中直接提取细菌dna的方法,并于1990年将其成功应用于dna杂交技术，研究发现1 g土壤中有4 000个以上不同的细菌种类,说明土壤中微生物多样性是极其丰富的。后来研究者发现16s rdna在原核微生物中普遍存在，并且含有相对保守和可变区域,在不同的个体间16s rdna基因序列也不会进行基因交换,因此，每一种生物都有自己的独特序列。1986年，pace［3]第一次以16s rdna为基础确定环境样品中的微生物，使人们对大量不可培养微生物群体有了全新的认识.此后,基于16s rdna基因的指纹图谱分析的现代分子生物学技术得到迅速发展，包括限制性片段长度多态性分析（rflp）、随机扩增dna多态性分析(rapd）、单链构象多态性分析(sscp）、基因芯片（microarray）、pcr—dgge/tgge 等，为全面揭示土壤微生物种群结构和遗传多样性提供了重要手段。其总的技术路线：分离微生物基因组dna,用特异性引物扩增16s rrna基因片段，再将该pcr扩增产物进行更深一步分析,从而可在种、属的水平上研究不同生境中的微生物种群结构及其动态变化［10]。
2 土壤微生物总dna的提取
从土壤样品中提取dna的方法大致可分为2类，即间接提取法和直接提取法。间接提取法首先是对土壤样品进行反复悬浮和离心，去除土壤等杂质，提取土壤微生物细胞，再采用酶裂解细胞提取微生物总dna。直接裂解法是不去除土壤等杂质,而是通过物理的、化学的、酶解等手段相结合,直接裂解土壤中的微生物细胞，使其释放dna，再进行提取和纯化。但不论采用何种方法，都存在一定的缺陷，要想提取较完整的dna需要具备以下几个条件: ①土壤微生物能从土壤中充分释放，尤其是那些紧紧吸附在土壤颗粒，甚至深藏于土壤微穴中的细菌等相对比较难分离的微生物。②对一些比较顽固的微生物，如革兰氏阳性菌、孢子和小细菌的裂解,需要更剧烈的处理，而这又会造成对裂解敏感的细菌dna折断。③采集土壤样品后应尽快提取dna，因为土壤在4 ℃储藏几周就会造成大分子dna的降解。
2.1 间接提取土壤微生物总dna
torsvik等[11］最先报道了从土壤中提取微生物dna的间接法,包括以下4个步骤：①分散土壤；②土壤微生物的提取(分离细胞与土壤）；③土壤微生物的纯化；④细胞裂解及dna纯化.
2.1.1 土壤分散 土壤微生物一般与土壤颗粒结合，包藏在土壤团聚体内,因此，最大限度地分散土壤是从土壤中分离提取微生物的关键。通常采用物理或化学法，或是二者相结合以达到微生物与土粒分离的目的。常用的物理分散技术是使用玻璃珠与土壤悬液一起振荡，或是使用韦林氏搅拌器（匀浆器、转子混合器）搅拌分散,或是使用超声波分散土壤团聚体等。而化学分散法是通过加入化学分散剂以达到促进微生物与土粒分离的目的。最常用的分散剂为0。2％焦磷酸钠，其他还有winogradsky盐溶液、tris缓冲液、生理盐水、六偏磷酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、纯水等［26]。值得注意的是，为有效地分散土壤，分散剂的种类、浓度、加入量、机械作用（振荡、搅拌和超声波等）的方式、时间以及容器的大小等均应加以考虑。还可以将化学试剂与机械方法结合来悬浮土壤颗粒。研究发现chelex100就是一种有效的土壤颗粒悬浮剂。各种分散方法分散效果不同,采用何种分散方法效果最佳目前尚无一致结论，而且防止细胞因物理、化学作用导致破裂提前释放dna很重要,处理不当会使dna降解。常用分离提取土壤微生物的土壤分散方法列入表1。
2。1.2 土壤微生物的提取 土壤微生物的提取通常采用离心分离法，既要使微生物与土壤颗粒分离，又要保证基本不破坏微生物细胞。由于土壤中细菌的平均密度（1.1 μg/cm3)远小于土壤矿物质的平均密度(2。6 μg/cm3）,因此采用离心或淘选法可使细菌与土壤颗粒得到较好的分离。hopkins等[17］采用密度逐级离心法分离出60%以上的土壤细菌.此外，也有学者提出用过滤法，即将土壤样品分散处理后，经20 μm或30 μm微孔筛真空抽滤，其滤液中即可能含有绝大多数土壤细菌，此过程操作简便，提取液中土壤残留物少，易于纯化.
由于土壤中的真菌、放线菌主要以菌丝的形态与土壤颗粒缠绕在一起以及细胞壁结构的特殊性，从土壤样品中分离提取真菌放线菌要比提取单细胞的细菌相对困难。迄今为止，国内外有关分离提取真菌的研究文献极少，且这些报道方法所提取的真菌菌丝只占真菌总生物量的极少部分。vilarino等[21］在前人研究的基础上提出了分离土壤真菌的原理：新鲜土壤经分散后，土壤悬浮液中的菌丝可附着在慢速转动的铜丝（直径150 μm）框上，洗脱后即得提取的土壤真菌。潘力等[22]以曲霉菌为例，采用微波处理菌丝并置于10× te buffer中即可得到dna,建立了一种快速提取丝状真菌dna的实验方法,为高通量快速筛选丝状真菌转化子奠定了基础。吴敏娜等[23]以传统土壤总dna提取方法及纯菌dna提取方法为基础，分别与蜗牛酶、纤维素酶进行组合、优化，得到7种不同的土壤真菌基因组dna提取方法。分离提取土壤细菌和真菌的流程如图1所示。
2.1.3 土壤微生物的纯化 目前常用两相分离技术对上述土壤微生物提取液进行纯化。两相分离技术最早为德国化学家albertsson于20世纪50年代所建立,当时主要用于生物大分子的分离.近些年该技术广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物工程等领域，是一种分离、纯化生物大分子、细胞、病毒的方法,该技术也逐步发展成为一种温和的生物分离方法，相对于原始的纯化手段具有过程简单、纯化时间较短等特点，应用领域广泛［24]。关于其分离机制目前尚不完全清楚,有人认为其分离的原理主要取决于不同组分的亲水性差异,也有人认为还与不同组分的电荷性质差异有关。当两种互不相溶的聚合物以一定浓度溶于水中时，便可形成体积不同的两相，被分离组分由于其与两相的亲和力不同，分别进入不同相从而达到分离的目的。目前应用最为广泛的是peg（聚乙二醇)/dextran(葡聚糖）系统和peg/无机盐（磷酸盐或硫酸盐）系统。对于不同的两相组分，分离时间不尽相同[25］。smith等[19］研究了应用两相分离技术从土壤中分离纯化非菌丝体微生物的效果，发现经充分混合静置一定时间后，即可形成上下两层体积比约为4∶1的两相分离系统，其中细菌主要富集在上层peg相,土壤残存颗粒将进入下层dextran相，经4次提取纯化，富集在上层peg相的细菌总量约达加入两相分离系统细菌总量的60%,而上层peg相中的土壤矿质颗粒总量仅占总加入量的4％以下。李妍等[26]用2%peg+6％dextran两相分离技术(a2pp）纯化细菌，测定细菌生物量，研究两相分离技术在土壤微生物研究领域的可应用性，结果表明采用0。1％胆酸钠、钠型离子交换树脂、玻璃珠与土壤一起在4 ℃下振荡2 h，能较好地分散、纯化土壤细菌.研究表明，两相分离技术同样有可能用于分离纯化土壤真菌.
2.2 直接提取土壤微生物总dna
现今的土壤细菌dna直接提取法是在ogram等[27］建立的方法基础上发展起来的，主要包括两个步骤:①原位细胞裂解；②dna提取和纯化.
2。2。1 原位细胞裂解 直接裂解土壤微生物细胞的方法包括：机械破碎法、化学法、酶解法及3种手段相结合.机械破碎法常用的有冻融法、微波、超声波法和玻璃微珠震荡法；化学法常用表面活性剂sds和sarkosyi、热酚、高盐、异硫氰酸胍等；酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶k、链霉蛋白酶等。其中溶菌酶不仅可处理革兰氏阳性菌细胞壁，还可水解糖苷键和腐殖酸。2种或多种方法相结合对dna的提取效果较好.王啸波等[28]采用pbs缓冲液洗涤土壤样品，结合sds裂解微生物细胞的方法，同时提取2种土壤样品的微生物dna和rna，结果表明该法提取的核酸不需要进一步处理，其纯度就可以满足后续的分子生物学试验,从而避免了由于纯化导致的核酸量的降低。熊开容等[29]采用冻融+玻璃珠+溶菌酶+sds方法提取了活性污泥中微生物dna，结果表明获得的dna适合于酶解和pcr扩增要求。
值得关注的是，土壤中微生物种类繁多，生理状态不同，革兰氏阳性和阴性细菌以及细菌与真菌的细胞壁结构和组成亦不相同。为了使提取的dna具有代表性，就必须保证土壤样品中所有微生物细胞裂解释放出核酸，因此必须根据试验的性质、要求选择适当裂解方法.研究表明，基于sds的高盐提取法会对一些革兰氏阳性细菌效果不好。张瑞福等[30]采用冻融+溶菌酶+sds方法提取3种芽孢杆菌（g+）dna，结果表明经冻融处理的霉状芽孢杆菌均提取到了dna,未经冻融处理的霉状芽孢杆菌未提取到dna,且冻融处理未对dna造成大的剪切，提取的dna片段还大于23.1 kb。张颖慧等[31]使用优化的ctab法提取真菌基因组dna。使用液氮冻融以及玻璃珠振荡的方法代替了传统的液氮研磨，实验结果表明该方法所需菌体量少,且得到的基因组dna比用传统的ctab法得到的基因组dna产率高、纯度好且步骤简单，适用于一次微量提取多个样品的基因组dna，可用于大部分分子生物学基本实验如pcr和dna的酶切等.
2.2.2 dna提取和纯化 在已报道的dna提取和纯化方法中，通常采用饱和酚或氯仿和蛋白酶处理，去除dna样品中的蛋白质和部分rna,然后对dna进行抽提，再用乙醇、异丙醇或聚乙二醇（peg）沉淀后，经羟基磷灰石柱或氯化铯密度梯度超速离心等进一步纯化。其他纯化方法有聚乙烯吡咯烷酮（pvpp)法、色谱法、电泳法、透析和过滤法、试剂盒法等。
lamontagne等[32]研究结果表明pvp能够与腐殖酸结合，起到有效去除提取的dna中腐殖酸杂质、提高dna纯度的作用。李靖宇等[33]采用氯化钙—sds-酶法对湿地土壤微生物dna进行提取，结果表明该方法能高效去除湿地土壤腐殖酸，纯度较高,能直接满足pcr扩增。李钧敏等[34]用含pvpp的缓冲液预洗dna样品,然后添加cacl2和牛血清白蛋白可去除其中的腐殖酸,用peg8000沉淀dna,可提高dna质量，并证实这是一种简便有效可直接应用于pcr分析的土壤微生物总dna的提取方法。蔡刘体等[35］采用 sds—ctab法提取烟草病圃土壤微生物总dna,该方法既可达到裂解效果,还有助于去除腐殖酸，有利于提高所提取dna 的质量。吴红萍等[36]采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除剂对粗提取的土壤微生物dna进行纯化后，可用于pcr扩增，并以细菌16s rdna基因引物可扩增到相应的片段。朱立成等［37]采用直接法提取土壤微生物总dna，然后用sephadex g—200凝胶离心层析法纯化，可得到纯度较高的dna。段学军等[38］采用稀释模板及巢式pcr法很好地解决了在dna提取纯化过程中不能完全去除腐殖质的问题。滕应等[39］将bio101 systems公司研制的fastprep多试管核酸提取系统与相应的fast dna spinkit for soil试剂盒联用，有效地提取了重金属复合污染的农田土壤微生物总dna.
没有哪种单一的纯化步骤可以除去所有污染物,故许多研究者已经将几种纯化步骤结合起来以期获得最好的纯化效果。smalla等[40］将粗提的dna进行3步纯化：①氯化铯密度梯度超速离心纯化；②醋酸钾沉淀;③geneclean纯化.发现经前2步纯化的dna通过稀释即可部分被限制性酶切和扩增，但如不经稀释而进行限制酶切和扩增，则必需进行最后一步纯化.
2.2.3 直接法和间接法的比较 研究表明，直接法获得的dna较多,但不易去除抑制剂，间接法提取的dna只占直接法的1/10，但分离的dna纯度较高,而且间接法得到的细菌量只占总菌群的25％～50％,直接法提得的dna却可以超过细菌总dna的60%。因此，要想获得大量dna，选择直接法较好，当所需dna量不大，而且要排除真核或胞外dna污染时，可用间接提取法.
直接提取对某些特定样品用特定的操作方法能获得较高的提取效率，但是对有些生物量不高的样品则很难得到足够的环境总dna用于后续操作，适合在样品生物量较大但采样量不大的情况下采用。间接提取在提取效率上远小于直接提取，但用间接提取法所得到的环境总dna纯度较高,所有样品能直接用于pcr扩增，并且能更好地体现样品中微生物的多样性,适用于有大量样品的情况。
2。3 dna的纯度和浓度测定
dna在260 nm处有吸收峰,腐殖酸在230 nm处有吸收峰，计算od230/od260（腐殖酸/dna）的比值可以确定所提dna中腐殖酸的污染程度。一般情况下od230/od260比值应在0.4～0。5之间为好， od230/od260比值越高，腐殖酸污染越严重。蛋白质在280 nm处有吸收峰，因此od260/od280比值经常被用来指示dna中蛋白质的污染程度,当od260/od280比值为1.8~2.2时,dna较纯,当受蛋白质或其他杂质污染时，od260/od280值则较低[41]。此外,还可采用pcr扩增检测dna的纯化质量，所用扩增引物见文献［42]。
提取的dna浓度也可根据测定的od260值计算，根据公式[dsdna]=50×od260×稀释倍数,计算dna的浓度（μg/ml）,换算出每克干土提取dna的量[43］;还可采用dyna quant 200荧光仪对纯化后dna的浓度进行测定［28]。
3 影响土壤微生物总dna提取的因子
土壤成分复杂,含有大量的有机及无机等多种生物活性抑制物，如腐殖酸、多酚类化合物、重金属等，它们的存在可能影响土壤dna的提取质量，抑制dna聚合酶的活性从而影响土壤微生物多样性的分析.研究发现，腐殖酸是土壤dna提取过程中极难去除的污染物，由于它的分子大小和理化性质与dna相似，过分注重腐殖酸的去除,势必会造成dna的大量损失，因此腐殖酸的有效去除是土壤dna提取的难点所在。
各种土壤类型、质地和成分的差异,都会影响土壤微生物dna的提取效果。zhou等［44］用sds-ctab法从8种土壤（包括沃土、沙沃土和沙黏土，其中黏土含量为5％~31％不等）中提取dna，平均获得dna的量为0。5～26。9 μg/g,并发现获得的dna量与土壤的有机磷含量有明显的正相关关系。另外，研究也发现,土壤中细菌的裂解效率与其中黏粒的含量呈明显的负相关.土壤中各粒级颗粒对细菌的吸附量从大到小的顺序为：黏粒、粉粒、细沙粒、粗沙粒，其中黏粒是粉粒的3.7～4.9倍、细沙粒的44。3～89.2倍、粗沙粒的262。0～799。0倍，细菌在粒径不同的土壤颗粒表面的最大与最小吸附量分别相差389.0和857。0倍，去有机质土壤颗粒对细菌吸附亲和力较含有机质土壤颗粒的大［45］。因此,不同的土壤适合于不同的dna提取方法，在土壤dna提取过程中，应针对土壤类别选取合适的提取方法，以便进行后续研究。
4 小结
从土壤微生物群体基因组的角度研究其多样性及功能是可行的方法，并受到广泛的关注[46]。因而越过分离培养的步骤，直接从土壤中获得总dna以分析土壤微生态群落结构，关键是如何尽可能全面地提取土壤中微生物的总dna.土壤本身成分复杂，有许多物质难以预料，对提取较好质量的dna提出了很高的要求。因此建立一种简单有效的提取方法显得非常重要。
间接法提取的微生物dna纯度较高,提取的种类和数量较少；直接提取法直接在土壤中裂解细胞,使其中内含物尽可能地释放,能够代表大部分的土壤微生物,但土壤中所含物质种类较复杂，所以提取的dna质量受到很大的影响，需要进一步纯化，而这些处理往往造成部分dna的丧失，可能使在土壤中本身存在量较少的种类丧失或检测不到，影响到土壤微生物多样性的分析.最近，milko等［47]发现一种taq dna聚合酶基因突变型可增加对腐殖酸等pcr抑制物的抗性,不需要对基因组dna进行纯化就可以进行后续的分子生物学分析，因此具有广泛的应用前景。
绝大多数直接提取法提取的dna片段长度不会超过23 kb，而dna的某些用途如宏基因组文库构建,需要大片段的dna，直接提取法对此几乎无能为力。
在dna提取产率高即表示其所代表的微生物多样性高的前提下，dna直接提取法被认为是较好的方法并被广泛应用［48］。但近年来有研究表明dna提取的产率高不等同于微生物的多样性高,间接提取法又再次被提出并用于相关研究[49］.这就要求在选择提取方法时不仅要试用直接提取和间接提取这两类方法，而且在每类方法中也要试用不同的处理组合方式，以使后续操作能顺利进行，并得到准确可信的研究结果.
评价一种土壤微生物dna提取方法是否有效,除了通常要求的提取片段无降解且比较完整外，还需要能够有效去除土壤中大量存在的影响后续实验的物质，如腐殖酸、腐殖酸似物、酚类化合物、重金属离子等;能在单位样本量中比较彻底地提取出微生物dna；提取方法应具有普适性，对土壤中大多数微生物能够有效等[50],且提取的dna能更好地代表土壤微生物的真实性和异质性.
5 展望
目前,国内外对土壤微生物总dna提取方法的报道很多,但每一种方法都存在一定的缺陷。因此，从土壤样品中提取dna还没有通用的最佳方案，需要根据具体的土壤特点、实验室条件和实验目的而定。在提取过程中还要兼顾实验操作是否简便，方法是否经济以及样品量是否充足。另外,将现代分子生物学技术与传统微生物研究方法结合起来，才能更全面地认识和理解土壤微生物群落多样性及其相应的生态功能。
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